《高效腸道屏障功能檢測方案：安捷倫Cytation＋艾瑋得器官芯片》

腸道作為人體消化系統(tǒng)的關(guān)鍵部分，其屏障功能宛如堅(jiān)固防線，守護(hù)著機(jī)體健康，既阻止有害物質(zhì)入侵，又維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，這在藥物研發(fā)、毒理學(xué)研究等諸多生物醫(yī)藥領(lǐng)域至關(guān)重要。但傳統(tǒng)檢測方法受技術(shù)瓶頸制約，在檢測效率及模擬真實(shí)生理環(huán)境方面表現(xiàn)欠佳，難以滿足科研快速推進(jìn)的需求。

澤匯生物引入的安捷倫 Cytation 與艾瑋得器官芯片強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，將成像技術(shù)與類器官模型結(jié)合，整合成像分析技術(shù)與高度模擬人體生理微環(huán)境的優(yōu)勢，為腸道屏障功能檢測開辟出一條高效、精準(zhǔn)的全新方案。

技術(shù)聯(lián)用的優(yōu)勢：

模擬生理環(huán)境：器官芯片可在芯片上構(gòu)建出包含腸道上皮細(xì)胞層、血管內(nèi)皮細(xì)胞層等類似體內(nèi)腸道組織的結(jié)構(gòu)，并通過微通道內(nèi)液體流動(dòng)模擬腸道內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸，而微孔板成像能對芯片內(nèi)細(xì)胞在這種模擬生理環(huán)境下的生長、形態(tài)變化及功能表達(dá)進(jìn)行可視化監(jiān)測。

多維度數(shù)據(jù)獲?。何⒖装宄上窦夹g(shù)中的熒光顯微鏡可觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化反映分子表達(dá)水平或代謝活性，共聚焦顯微鏡能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞三維重建，結(jié)合器官芯片模擬的復(fù)雜微環(huán)境，可從細(xì)胞形態(tài)、分子表達(dá)、空間分布等多維度獲取細(xì)胞在 3D 培養(yǎng)條件下的數(shù)據(jù)。

設(shè)備與方法

設(shè)備

Agilent細(xì)胞成像多功能微孔板檢測儀

  l 顯微成像和微孔板檢測的整合可同時(shí)提供細(xì)胞表型數(shù)據(jù)和定量數(shù)據(jù)，提高實(shí)驗(yàn)效率

l 集成化軟件簡單易用，分析模塊不設(shè)限

l 圖像采集、處理和數(shù)據(jù)分析輕松實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化流程

l 1.25 倍-100 倍物鏡，結(jié)合 7 種成像模式，為用戶提供更多選擇

l 超過 20 種熒光通道選擇，拼插式快捷更換，滿足現(xiàn)在和未來應(yīng)用

l 配置共聚焦成像和水鏡可清晰觀察3D細(xì)胞/類器官等較厚樣本

l 環(huán)境控制包括溫度和 CO₂/O₂ 控制與監(jiān)測，無需放置培養(yǎng)箱

l 支持與自動(dòng)化設(shè)備對接，實(shí)現(xiàn)更高通量的檢測與成像分析

l 多種成像和檢測模式可進(jìn)行數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，適用于任何檢測

艾瑋得高通量無膜屏障芯片

   屏障芯片產(chǎn)品是一種創(chuàng)新性的可灌注 3D 培養(yǎng)芯片。它具備三通道獨(dú)立以及液體控制技術(shù)等特點(diǎn)，憑借這些特性，實(shí)驗(yàn)人員能夠靈活安排細(xì)胞 / 組織的空間分布與共培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)和信號(hào)的無障礙交互。在模型構(gòu)建方面，這款芯片優(yōu)勢明顯，可構(gòu)建多種管狀及復(fù)雜模型。并且，借助芯片自身的諸多優(yōu)勢，構(gòu)建出的模型能更接近人體實(shí)際情況。借助固體邊緣效應(yīng)構(gòu)建的無膜式屏障，該芯片不僅能對三通道中的細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)定位，還能更好地促進(jìn)細(xì)胞間相互作用。此外，配合搖擺灌注儀使用時(shí)，該芯片還可達(dá)成連續(xù)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)養(yǎng)分的充分交換，為細(xì)胞和組織的培養(yǎng)提供更適宜的環(huán)境，助力科研人員開展更深入的研究。

聯(lián)用方法

（二）芯片構(gòu)建與細(xì)胞接種

l 首先，在微流控芯片的細(xì)胞培養(yǎng)腔室中，利用微加工技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞外基質(zhì)層。例如，將稀釋后的樣本細(xì)胞均勻地鋪展在腔室內(nèi)，使其形成類似于體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。

l 將培養(yǎng)好的腸道上皮細(xì)胞以合適的密度接種到芯片的上皮細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域，同時(shí)可根據(jù)需要接種其他輔助細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞等），構(gòu)建完整的腸道屏障模型。接種后，將芯片放置在培養(yǎng)箱中，讓細(xì)胞貼壁并開始生長。

l 在微孔板的孔中，接種與芯片上相同類型和狀態(tài)的細(xì)胞，作為對照或用于初步篩選實(shí)驗(yàn)條件。

（三）成像與監(jiān)測

l 利用微孔板成像技術(shù)，在細(xì)胞接種后的不同時(shí)間點(diǎn)，對微孔板中的細(xì)胞進(jìn)行成像。通過觀察細(xì)胞的形態(tài)、熒光標(biāo)記物的表達(dá)等情況，初步評(píng)估細(xì)胞的生長狀態(tài)和功能變化。例如，使用熒光標(biāo)記的緊密連接蛋白抗體，觀察細(xì)胞間緊密連接的形成情況，以評(píng)估腸道屏障的完整性。

l 由于芯片內(nèi)細(xì)胞的 3D 結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，成像時(shí)可采用共聚焦成像等技術(shù)（C10），獲取細(xì)胞在不同深度層面的信息，觀察細(xì)胞在模擬腸道微環(huán)境下的動(dòng)態(tài)變化，如細(xì)胞的遷移、分化以及屏障功能的改變等。

應(yīng)用案例

01細(xì)胞培養(yǎng)：

使用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系 Caco-2 在器官芯片中制備腸道模型。器官芯片 的每個(gè)芯片由 9 個(gè)孔（3 x 3）組成，通過三個(gè)微流體通道（寬 400 µm，高 220 µm）連接。        

02屏障完整性檢測：

在培養(yǎng)的第 6 天，向培養(yǎng)基通道 1 中加入含有熒光染料(FITC-Dextran 150 kDa，TRITC-Dextran 4.4 kDa)和凋亡誘導(dǎo)劑 Staurosporine(0 至 50 µM)的培養(yǎng)基，并立即使用 BioTek Cytation 1 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)對器官芯片進(jìn)行成像。

Cytation 1 系統(tǒng)具有完善的環(huán)境控制，包括CO₂/O₂濃度控制和溫度控制，將系統(tǒng)溫度設(shè)置并維持在 37 ℃，在24小時(shí)內(nèi)每小時(shí)捕獲一次每個(gè) OrganoPlate^® 芯片的熒光圖像。

圖 2. 使用安捷倫 BioTek Cytation 1 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)進(jìn)行腸道屏障完整性測定

03結(jié)果與討論

Caco-2 細(xì)胞在器官芯片中培養(yǎng)，并用 Staurosporine(0 至 50 µM，24 小時(shí))處理，然后使用 Cytation 1 評(píng)估其屏障完整性。

圖 3-4 數(shù)據(jù)觀察到：未加細(xì)胞和 0 µM Staurosporine 條件作為對照，顯示出預(yù)期的圖像和接近 1 和 0 的泄漏分?jǐn)?shù)。

圖 3. Staurosporine 處理的 Caco-2 tubule 中 FITC - 葡聚糖（150 kDa）的滲透性

圖 4. Staurosporine 處理的 Caco-2 tubule 中 TRITC-dextran（4.4 kDa）的滲透性

圖 5 顯示在 Staurosporine 處理的細(xì)胞中，觀察到劑量和時(shí)間依賴性的屏障完整性喪失，表現(xiàn)為兩種熒光染料從培養(yǎng)基向凝膠通道的滲透。通過計(jì)算泄露分?jǐn)?shù)和表觀滲透率（Papp），進(jìn)一步量化了屏障功能的破壞程度。

圖 5. 屏障完整性數(shù)據(jù)分析和表觀滲透率

如果想要在器官芯片上進(jìn)行更高分辨率的 3D 組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)，推薦使用增加了轉(zhuǎn)盤共聚焦系統(tǒng)的 Cytation 高級(jí)型號(hào)：Cytation C10 共聚焦微孔板成像檢測系統(tǒng)。

圖 6. 器官芯片的 3D 渲染。使用安捷倫 BioTek Cytation C10 共聚焦成像系統(tǒng)在 40 倍物鏡下獲取共聚焦熒光圖像。以 1 µm的步進(jìn)在多個(gè) z 高度采集 3 x 3 圖像拼接，跨越 150 微米的 Z 高度范圍。細(xì)胞核用 Hoechst 33342 標(biāo)記，細(xì)胞膜用 GFP 標(biāo)記。3D 渲染使用安捷倫 BioTek Gen5 軟件中的 3D 查看器工具生成。

引用文獻(xiàn)：

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