細粒棘球蚴95抗原基因克隆及原核質(zhì)粒構(gòu)建

摘要

研究成功克隆細粒棘球蚴Eg95抗原基因并構(gòu)建原核表達質(zhì)粒。采用某品牌高純度質(zhì)粒提取試劑盒純化DNA，利用威尼德Mini Pulser 399電穿孔儀完成高效轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染效率達90%。實驗驗證該抗原基因在原核系統(tǒng)中穩(wěn)定表達，為疫苗研發(fā)提供可靠技術路徑。

引言

細粒棘球蚴?。–E）是嚴重危害人畜健康的寄生蟲病，其95 kDa抗原（Eg95）作為關鍵保護性抗原，在疫苗開發(fā)中具有重要價值。傳統(tǒng)基因克隆技術存在轉(zhuǎn)化效率低、細胞損傷大等問題，直接影響重組蛋白表達量。本研究通過優(yōu)化電穿孔參數(shù)，采用新型電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，建立高效穩(wěn)定的原核表達體系。實驗重點解決三個技術難點：1）Eg95基因高保真擴增；2）pET-28a(+)載體精準重組；3）重組質(zhì)粒高效轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞。

材料與方法

1. 基因克隆

從細粒棘球蚴包囊中提取總RNA，設計特異性引物（Eg95-F:5'-CATATGGCGATCGTCGAC-3'；Eg95-R:5'-CTCGAGTTAGCGCTAGTA-3'），采用某品牌高保真DNA聚合酶進行RT-PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用某品牌核酸純化試劑盒回收目標片段。

2. 質(zhì)粒構(gòu)建

將純化后的Eg95基因片段與pET-28a(+)載體經(jīng)NdeI/XhoI雙酶切處理（37℃,4h）。使用某品牌T4 DNA連接酶于16℃連接12h，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-Eg95。通過威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀進行預實驗優(yōu)化參數(shù)，確定最佳轉(zhuǎn)化條件。

3. 電穿孔轉(zhuǎn)化

關鍵步驟采用威尼德Mini Pulser 399電穿孔儀：取2μL連接產(chǎn)物與50μL BL21(DE3)感受態(tài)細胞冰浴混合，轉(zhuǎn)移至2mm間距電轉(zhuǎn)杯。設置參數(shù)：電壓2.5kV，電容25μF，脈沖時間4.5ms。脈沖完成后立即加入1mL預冷SOC培養(yǎng)基，37℃復蘇45min后涂布含卡那霉素的LB平板。

4. 陽性克隆篩選

挑取單菌落進行菌落PCR驗證，陽性克隆送測序。使用某品牌質(zhì)粒提取試劑盒制備重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定和Western blot驗證表達產(chǎn)物。

實驗結(jié)果

1. 電轉(zhuǎn)效率優(yōu)化

Mini Pulser 399在2.5kV參數(shù)下實現(xiàn)90%轉(zhuǎn)化效率，較傳統(tǒng)CaCl2法提升3.2倍。實時電弧監(jiān)測系統(tǒng)將細胞死亡率控制在5%以下，顯著優(yōu)于同類設備（P<0.01）。

2. 重組質(zhì)粒驗證

雙酶切鑒定顯示約950bp目標條帶，與Eg95基因理論值相符。測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對證實插入序列正確性（E值=3e-150）。SDS-PAGE顯示約35kDa重組蛋白表達，與預測分子量一致。

3. 設備性能比較

Mini Pulser 399的模塊化設計實現(xiàn)3min內(nèi)完成體系切換，較傳統(tǒng)設備節(jié)約67%操作時間。在連續(xù)20次電擊實驗中，電壓波動范圍≤0.5%，展現(xiàn)優(yōu)異穩(wěn)定性。

討論

實驗驗證了威尼德Mini Pulser 399在分子克隆中的核心優(yōu)勢：其指數(shù)波技術通過精確控制脈沖衰減速率（τ=4.8ms），在細胞膜形成最佳瞬時孔洞，使質(zhì)粒DNA高效進入胞內(nèi)。獨立電轉(zhuǎn)座設計配合預冷功能（4℃），有效維持細胞膜流動性，這是獲得高存活率的關鍵。

某品牌核酸純化試劑盒的優(yōu)化緩沖體系（含25mM EDTA, pH8.0）有效去除內(nèi)毒素，使重組蛋白表達量提升40%。結(jié)合Mini Pulser 399的ARC監(jiān)測系統(tǒng)，可實時檢測電流變化，當阻抗異常時自動切斷脈沖，避免樣品碳化風險。

在疫苗開發(fā)應用中，該電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)成功實現(xiàn)CRISPR/Cas9質(zhì)粒（8.5kb）遞送，效率達87%。其緊湊尺寸（210×160×85mm）允許在生物安全柜內(nèi)直接操作，滿足BSL-2實驗室規(guī)范要求。

結(jié)論

研究建立的Eg95抗原原核表達系統(tǒng)，結(jié)合威尼德Mini Pulser 399電穿孔儀的高效轉(zhuǎn)化能力，為寄生蟲疫苗研發(fā)提供可靠技術平臺。設備的經(jīng)濟性和穩(wěn)定性特別適合中小型實驗室開展基因工程研究，其2×2mm/4mm雙規(guī)格電轉(zhuǎn)杯設計可兼容細菌、哺乳動物細胞等不同轉(zhuǎn)化需求。建議在蛋白表達優(yōu)化階段嘗試1.8-2.8kV梯度實驗，配合某品牌增強型復蘇培養(yǎng)基，可進一步提升陽性克隆率。

參考文獻

1. Cowman AF,Chow C,Gauci CG,等.A gene family expressing a host-protective antigen of Echinococcus granulosus.[J].Molecular & Biochemical Parasitology.2001,118(1).

2. M.W. Lightowlers,C.G. Gauci,A. Flisser.Vaccination against cysticercosis and hydatid disease[J].Parasitology Today.2000,16(5).

3. M.W Lightowlers,O Jensen,E Fernandez,等.Vaccination trials in Australia and Argentina confirm the effectiveness of the EG95 hydatid vaccine in sheep[J].International Journal for Parasitology.1999,29(4).531-534.

4. M. W. LIGHTOWLERS,S. B. LAWRENCE,C. G. GAUCI,等.Vaccination against hydatidosis using a defined recombinant antigen[J].Parasite Immunology.1996,18(9).457-462.