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探索活性分子發(fā)揮效應(yīng)的 “神秘“ 機(jī)制_MedChemExpress(MCE 中國)

來源：MedChemExpress LLC 2025年05月29日 14:22

當(dāng)找到有效的活性分子后......
這些分子的作用靶點是什么？
如何發(fā)揮它們的生物學(xué)效應(yīng)？
本期咱們一起探討藥物找靶的新策略，Let’s Go!

Section.01

藥物靶點的識別

明確藥物的臨床適用范圍是藥物發(fā)現(xiàn)與設(shè)計的關(guān)鍵，除此之外，闡明藥物的作用靶點也在疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。

諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎得主 Paul Ehrlich 曾說過“corpora non agunt nisi fixate”—— 藥物不會發(fā)揮作用，除非它們被結(jié)合?！杜＝蛏锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)詞典》將藥物靶點定義為與特定化合物相互作用并受其活性調(diào)節(jié)的生物實體，通常是蛋白質(zhì)或基因。

有潛力的藥物靶點都有哪些特點^[1]？

1. 在某種疾病的病理生理中有確鑿的作用，和/或能夠改變疾病進(jìn)程；

2. 在全身范圍內(nèi)的非均勻分布；

3. 有可用于評估成藥性的三維結(jié)構(gòu)；

4. 易于進(jìn)行“檢測”，便于高通量篩選；

5. 具有良好的毒性特征，可以通過表型數(shù)據(jù)預(yù)測潛在的不良反應(yīng)；

6. 具有有利的知識產(chǎn)權(quán) (IP) 狀態(tài) (這一點主要與新藥研發(fā)公司相關(guān))。

新藥發(fā)現(xiàn)主要分為基于靶點的藥物發(fā)現(xiàn) (Target-based drug discovery, TDD) 和基于表型的藥物發(fā)現(xiàn) (Phenotypic drug discovery, PDD)。對于 PDD 來說，從大規(guī)?；衔镏泻Y選并驗證得到活性分子后，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)并闡明其作用靶點更是至關(guān)重要！

藥物靶點識別的方法主要分為計算機(jī)預(yù)測與實驗找靶。

計算機(jī)預(yù)測通常利用數(shù)據(jù)挖掘、藥效團(tuán)模型匹配、正反分子對接技術(shù)和藥物-靶標(biāo)相似性算法等，識別小分子可能作用的靶點。下面是一些常用的靶標(biāo)預(yù)測網(wǎng)站，有需可參考喔~

表 1. 常用的靶標(biāo)預(yù)測網(wǎng)站。

雖然通過預(yù)測的方法能夠快速篩選出大量潛在靶點，但精準(zhǔn)度相對不高，而且通常無法定位到某種細(xì)胞或組織中。由于靶點可能在不同的細(xì)胞中表達(dá)水平不同或發(fā)揮不同的作用，這種缺乏細(xì)胞特異性的預(yù)測可能會導(dǎo)致在實驗驗證階段的失敗。

實驗找靶則是通過具體的生物實驗來篩選靶點，其底層邏輯一般是通過各種實驗方法找到細(xì)胞或組織中能夠與藥物結(jié)合的潛在蛋白，而后通過結(jié)合層面和功能層面的雙重驗證來確認(rèn)靶點在疾病中的作用以及藥物可以通過調(diào)節(jié)該靶點功能從而發(fā)揮藥效。這不僅能夠提高靶點篩選的準(zhǔn)確性，也為靶點選擇提供了更豐富的生物學(xué)背景，使得藥物研發(fā)更具針對性和有效性。

實驗找靶常用的方法主要有 DARTS、SPR 和 Pulldown 技術(shù)等，且看小 M 為大家逐一介紹~

Section.02

DARTS 找靶技術(shù)

藥物親和反應(yīng)靶點穩(wěn)定性（Drug affinity responsive target stability, DARTS）的概念最初由 Brett Lomenick 等人于 2009 年提出，其基本原理是靶蛋白與小分子配體結(jié)合后穩(wěn)定性增加，可以增強(qiáng)靶蛋白對蛋白酶酶解作用的抗性，以此來進(jìn)行靶蛋白篩選，同時無需對小分子進(jìn)行修飾^[2]。

DARTS 找靶的一般實驗流程：

1. 蛋白庫的制備 (通常為目標(biāo)細(xì)胞或組織的蛋白裂解液)；

2. 蛋白裂解液與小分子共孵育；

3. 蛋白酶水解 (合適的蛋白酶濃度至關(guān)重要)；

4. 通過考馬斯亮藍(lán)染色或銀染等方法檢測對照組和加藥組蛋白的差異；

5. 目標(biāo)蛋白凝膠條帶收集；

6. 通過質(zhì)譜等方法對目標(biāo)蛋白進(jìn)行鑒定。

圖 1. 利用 DARTS 技術(shù)找靶的流程。

文獻(xiàn)案例

作者通過表型篩選及驗證發(fā)現(xiàn)藥物 desloratadine 在體內(nèi)和體外實驗中都能夠顯著抑制肝細(xì)胞癌 (HCC) 的生長和增殖。為了探究 desloratadine 發(fā)揮抗癌生物活性的分子機(jī)制，作者通過 DARTS 實驗發(fā)現(xiàn)了 53 種潛在靶蛋白，并從中選擇了 5 種感興趣的蛋白質(zhì)修飾酶進(jìn)行進(jìn)一步研究。通過蛋白表達(dá)、Knockdown、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲和遷移以及體內(nèi)實驗等驗證了 desloratadine 通過靶向 NMT1 蛋白調(diào)節(jié) HCC 的發(fā)展，利用 SPR 技術(shù)驗證了 desloratadine 和 NMT1 蛋白的結(jié)合，通過分子對接、蛋白點突變聯(lián)合 SPR 技術(shù)找到了 desloratadine 和 NMT1 蛋白的結(jié)合位點。

圖 2. 利用 DARTS 技術(shù)發(fā)現(xiàn) desloratadine 通過靶向 NMT1 蛋白調(diào)節(jié) HCC 的發(fā)展^[3]。

Section.03

SPR 找靶技術(shù)

表面等離子共振 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 是一種無標(biāo)記、實時檢測分子相互作用的技術(shù)。它基于表面等離子共振原理，實時監(jiān)測分子在固體表面 (通常是金屬表面) 上的結(jié)合與解離過程。

雖然 SPR 實驗通常用來檢測兩個分子之間的相互作用，但是 SPR 的這一特性也使其可以用于從復(fù)雜樣品中“垂釣”與藥物相互作用的分子。

實驗時，將藥物固定在芯片上，蛋白裂解液稀釋為不同濃度，采用多濃度上樣的方式，將不同濃度的裂解液與藥物互作，收集與小分子結(jié)合的蛋白并通過高分辨質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，從而得到藥物的潛在靶蛋白。同時，SPR 技術(shù)也常用于靶蛋白與藥物的親和力驗證。

圖 3. 利用 SPR 技術(shù)找靶的流程。

文獻(xiàn)案例

作者通過細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡等表型實驗從 1,504 種 FDA 上市藥物中篩選并驗證了 Lomitapide 對耐藥多發(fā)性骨髓瘤 (Multiple myeloma，MM) 細(xì)胞有很好的抗腫瘤活性，體內(nèi)實驗也證實 lomitapide 可以抑制 MM 的疾病進(jìn)程。

為了確定 lomitapide 的潛在靶點，作者利用 SPR 結(jié)合 HPLC-MS 篩選得到 39 個可以與 lomitapide 結(jié)合的蛋白，并選擇了 MS 分析的 PARP14 蛋白進(jìn)行驗證。通過 SPR 實驗證實 lomitapide 與 PARP14 蛋白能夠直接結(jié)合 (Kd = 101 nM)，并在后續(xù)實驗中利用 knockout 證實 Lomitapide 通過靶向 PARP14 誘導(dǎo) MM 線粒體功能障礙和線粒體自噬，從而揭示了 Lomitapide 對抗 MM 的新機(jī)制。

Section.04

SPIDER 鄰近標(biāo)記

Pull Down 技術(shù)

特異性糖基化作為標(biāo)識報告物 (Specific Pupylation as IDEntity Reporter, SPIDER) 是一種基于底物的鄰近標(biāo)記活性和鏈霉親和素 (SA)-生物素系統(tǒng)來識別蛋白質(zhì)-生物分子相互作用的方法。

當(dāng)靶蛋白 (Prey) 與帶有生物素標(biāo)記的誘餌分子 (Bait) 發(fā)生相互作用時，會同時與生物素偶聯(lián)上的 SAm-PupE 靠近，在 PafA 酶的催化作?下，PupE 的 C 末端會與 Prey 蛋白表面的賴氨酸殘基共價相連，從而實現(xiàn)對靶蛋白的捕獲。該過程可以將生物分子與蛋白質(zhì)之間的非共價結(jié)合相互作用轉(zhuǎn)換為 SAm-PupE 與靶蛋白的共價連接，從而能夠穩(wěn)定地用于后續(xù)靶蛋白的富集、鑒定和分析。

圖 5. SPIDER 技術(shù)原理示意圖。

對于實驗找靶而言，針對藥物特點選擇合適的實驗方案尤為重要，一起來看看上述 3 種藥物找靶技術(shù)各自的應(yīng)用范圍吧！

表 2. 不同藥物找靶技術(shù)的特點及應(yīng)用范圍。

那么有的小伙伴可能會問了，找到潛在結(jié)合蛋白之后，要如何驗證這些靶點是否是疾病的靶點呢？活性分子又是否是通過某個靶點發(fā)揮藥效的呢？別著急，后續(xù)的驗證方法小 M 也為你總結(jié)好了，噔噔噔噔~

表 3. 實驗找靶后續(xù)驗證方法舉例。

看了小 M 的介紹，大家現(xiàn)在有沒有一些找靶的思路了呢？MCE 藥物找靶平臺提供多種找靶技術(shù)，結(jié)合經(jīng)驗豐富的蛋白表達(dá)純化和分子互作研究平臺，可以為藥物潛在靶點的識別和驗證提供全面和個性化的實驗方案。歡迎來和小 M 一起探討~

產(chǎn)品推薦

藥物找靶服務(wù)

MCE 提供多種找靶技術(shù)，為藥物潛在靶點的識別和驗證提供全面和個性化的實驗方案。

SPR 檢測服務(wù)

MCE 使用 Biacore 8K、Biacore 1K、Biacore T200 等儀器，可以進(jìn)行抗原-抗體、蛋白-蛋白、抗體-受體、核酸-蛋白、蛋白-小分子化合物等的親和力分析，能夠為客戶提供定制的多樣性服務(wù)。

分子互作檢測服務(wù)

MCE 擁有專業(yè)的分子互作檢測平臺，包括 SPR、BLI、ITC、MST 和 nanoDSF 等，可以快速評價分子間相互作用親和力，并提供基于親和力的藥物篩選服務(wù)。

[1] Isabella Gashaw, et al. What makes a good drug target?. Drug Discovery Today. 2012.S24-S30.

[2] Lomenick B, et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(51):21984-21989.

[3] Tan, XP., et al. Blockade of NMT1 enzymatic activity inhibits N-myristoylation of VILIP3 protein and suppresses liver cancer progression. Sig Transduct Target Ther 8, 14 (2023).

[4] Honghao Zhang, et al.Targeting PARP14 with lomitapide suppresses drug resistance through the activation of DRP1-induced mitophagy in multiple myeloma. Cancer Letters.2024.

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