研究背景

基于研究發(fā)現(xiàn)的肝臟 - 腦 - 腸神經(jīng)反射弧對維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵作用，特別是其對腸道調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（pTreg 細(xì)胞）生成和維持的影響，本研究方案旨在進(jìn)一步深入探究該軸在腸道免疫調(diào)控中的具體機(jī)制。通過構(gòu)建類器官模型并結(jié)合 Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯(lián)芯片動態(tài)灌流系統(tǒng)，模擬體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境，以更精準(zhǔn)地揭示肝 - 腦 - 腸軸相互作用及其在腸道免疫中的功能。

研究目的

構(gòu)建肝臟、腦干和腸道類器官，并成功將其整合至 Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯(lián)芯片動態(tài)灌流系統(tǒng)中，模擬體內(nèi)肝 - 腦 - 腸軸的生理結(jié)構(gòu)和功能聯(lián)系。

研究肝臟 - 腦 - 腸神經(jīng)反射弧對腸道 APCs（抗原呈遞細(xì)胞）及 pTreg 細(xì)胞分化、增殖及功能的影響機(jī)制。 探索該軸在腸道炎癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為開發(fā)針對腸道免疫相關(guān)疾病的新型治療策略提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。

一、 類器官構(gòu)建與芯片整合

1. 類器官模塊選擇

1.1 肝臟模塊：

- 來源：人iPSC分化的肝類器官（含Kupffer細(xì)胞）

- 功能：感知腸道來源代謝物（如SCFAs、LPS），激活迷走神經(jīng)傳入

1.2 腸道模塊：

- 來源：結(jié)腸類器官（含CX3CR1?巨噬細(xì)胞/CD103? DCs）

- 功能：維持pTreg細(xì)胞生態(tài)位，表達(dá)ALDH/視黃酸

1.3 神經(jīng)模塊：

- 來源：人iPSC分化的迷走神經(jīng)節(jié)類器官 + 腸神經(jīng)元

- 功能：傳遞肝-腦干（NTS）-迷走傳出-腸神經(jīng)信號

2. 多器官芯片連接設(shè)計(jì)

Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯(lián)芯片動態(tài)灌流系統(tǒng)搭建：將構(gòu)建好的肝臟、腦干和腸道類器官分別植入 Kirkstall Quasi Vivo 系統(tǒng)的相應(yīng)芯片中，通過精確的管道連接和灌流設(shè)置，模擬體內(nèi)血液循環(huán)和組織間液流動，使三個(gè)類器官在動態(tài)的微環(huán)境中相互連接和作用。優(yōu)化灌流參數(shù)，如流速、流量等，確保類器官之間的物質(zhì)交換和信號傳遞接近體內(nèi)真實(shí)生理狀態(tài)。

二、 關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)干預(yù)

1. 神經(jīng)通路模擬

- 激活組：在肝臟模塊添加腸道代謝物（丁酸鹽/LPS），誘導(dǎo)迷走神經(jīng)激活

- 抑制組：

- 肝迷走神經(jīng)切斷（HVx模擬）：物理阻斷肝-神經(jīng)模塊連接

- 藥理學(xué)阻斷：添加毒蕈堿受體拮抗劑（如阿托品）

2. 免疫應(yīng)答檢測

- 腸道模塊輸出：

- pTreg細(xì)胞比例（流式檢測：CD4?FoxP3?RORγt?）

- APC的ALDH活性（Aldefluor染色）

- 視黃酸合成量（HPLC-MS檢測）

三、 動態(tài)灌流參數(shù)

四、實(shí)驗(yàn)檢測指標(biāo)

4.1 細(xì)胞水平檢測

• 采用流式細(xì)胞術(shù)分析腸道類器官中 pTreg 細(xì)胞的比例、數(shù)量及其表面標(biāo)志物的表達(dá)情況；同時(shí)檢測腸道 APCs（包括樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）的亞群組成、活化狀態(tài)以及醛脫氫酶（ALDH）表達(dá)水平和視黃酸合成能力等指標(biāo)，評估肝 - 腦 - 腸軸對腸道免疫細(xì)胞的調(diào)控作用。

• 利用免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡觀察類器官間神經(jīng)元與免疫細(xì)胞的相互作用情況，如神經(jīng)纖維與腸道 APCs 的接觸部位、信號傳遞相關(guān)蛋白的表達(dá)等，從細(xì)胞層面揭示肝 - 腦 - 腸軸的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

4.2 分子水平檢測

• 通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）檢測相關(guān)基因的表達(dá)變化，包括神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)基因（如神經(jīng)遞質(zhì)受體、離子通道等）、免疫相關(guān)細(xì)胞因子（如 TGF-β、IL-10、IL-17 等）以及 pTreg 細(xì)胞分化和功能相關(guān)基因（如 Foxp3、RORγt 等）。分析肝 - 腦 - 腸軸在不同實(shí)驗(yàn)條件下對這些基因表達(dá)的調(diào)控作用，探討其潛在的分子機(jī)制。

• 運(yùn)用 Western blot 技術(shù)檢測類器官中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平和修飾狀態(tài)，如神經(jīng)遞質(zhì)受體蛋白、信號通路相關(guān)蛋白（如 pERK1/2 等）以及免疫相關(guān)蛋白（如免疫球蛋白、細(xì)胞粘附分子等）。通過蛋白表達(dá)的定量分析，進(jìn)一步明確肝 - 腦 - 腸軸在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫調(diào)控中的作用途徑。

4.3 功能水平檢測

• 評估腸道類器官的屏障功能，如通過檢測腸道上皮細(xì)胞層的通透性（使用熒光標(biāo)記的大分子物質(zhì)進(jìn)行透性實(shí)驗(yàn)）、緊密連接蛋白的表達(dá)等指標(biāo)，了解肝 - 腦 - 腸軸對腸道屏障完整性的影響，以及在腸道炎癥發(fā)生過程中該軸如何調(diào)節(jié)腸道屏障功能以維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

• 進(jìn)行體外免疫細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，如將腸道 APCs 與 T 細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測 T 細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞因子分泌情況，分析肝 - 腦 - 腸軸對 APCs 免疫功能的調(diào)節(jié)作用以及其對 T 細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響；同時(shí)開展 pTreg 細(xì)胞抑制功能實(shí)驗(yàn)，評價(jià)肝 - 腦 - 腸軸調(diào)節(jié)的 pTreg 細(xì)胞在抑制腸道炎癥反應(yīng)中的作用效果。

五、數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)方法

使用專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件對實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對于多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），若組間方差不齊則采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法；兩組間均數(shù)比較則使用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用 Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)或 Spearman 秩相關(guān)檢驗(yàn)。以 P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，所有數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SEM）表示。通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的系統(tǒng)分析，深入挖掘肝 - 腦 - 腸軸在腸道免疫調(diào)控中的作用機(jī)制和潛在規(guī)律。

六、預(yù)期結(jié)果

6.1 成功構(gòu)建并整合肝臟、腦干和腸道類器官至 Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯(lián)芯片動態(tài)灌流系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠模擬體內(nèi)肝 - 腦 - 腸軸的生理結(jié)構(gòu)和功能聯(lián)系，為研究三者之間的相互作用提供一個(gè)穩(wěn)定、可靠的體外模型。

6.2 在正常生理狀態(tài)下，肝 - 腦 - 腸軸通過神經(jīng)信號傳導(dǎo)維持腸道 APCs 的正常功能和 pTreg 細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)水平；當(dāng)神經(jīng)通路被阻斷時(shí)，腸道 APCs 的 ALDH 表達(dá)和視黃酸合成能力下降，pTreg 細(xì)胞數(shù)量減少，腸道免疫穩(wěn)態(tài)遭到破壞，表現(xiàn)出類似炎癥性腸病的免疫失衡特征。

6.3 在腸道炎癥模型中，肝 - 腦 - 腸軸的神經(jīng)反射活動增強(qiáng)，試圖通過調(diào)節(jié)腸道 APCs 和 pTreg 細(xì)胞來緩解腸道炎癥反應(yīng)。而通過藥物干預(yù)調(diào)節(jié)該軸的功能（如激活或抑制特定神經(jīng)遞質(zhì)受體），可以有效改善腸道炎癥癥狀，增加 pTreg 細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)其免疫抑制功能，從而為治療腸道炎癥性疾病提供新的潛在治療靶點(diǎn)和策略。

6.4 本研究將深化對肝 - 腦 - 腸軸在腸道免疫調(diào)控中作用機(jī)制的認(rèn)識，為開發(fā)基于神經(jīng) - 免疫調(diào)節(jié)的新型治療策略提供關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。通過Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片動態(tài)灌流系統(tǒng)模擬體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境，不僅有助于更精確地研究細(xì)胞間的相互作用和信號傳遞，還為未來的個(gè)性化醫(yī)療和藥物研發(fā)提供了創(chuàng)新的研究平臺和工具。

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