HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)方略

人臍靜脈內(nèi)皮細胞 (HUVEC)，是從臍帶靜脈中分離出來的原代細胞。這種細胞是研究內(nèi)皮細胞的模型系統(tǒng)，研究相關(guān)的低氧、炎癥、氧化應激、感染反應以及正常和腫瘤相關(guān)血管生成等應用。

1：HUVEC細胞形態(tài)：

內(nèi)皮細胞樣，貼壁生長，鵝卵石狀外觀，核大而暗；

在增殖過程中，細胞小且大小均勻，有絲分裂指數(shù)高，無平滑肌細胞。

很多小伙伴認為沒有包被培養(yǎng)瓶似乎對培養(yǎng)影響不大，這里建議大家，復蘇和傳代均需要包被，包被后的細胞長的更圓潤飽滿傳代后的貼壁率也會有所提高。
1、在開始操作程序前，提前準備好所需要的試劑，重組人纖連蛋白、pbs磷酸緩沖液，離心管、移液槍、培養(yǎng)瓶等，以確保盡快完成解凍程序。

2、以 T25 培養(yǎng)瓶為例:吸取2.5mlPBS磷酸鹽緩沖液轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶中，再將100ul移液槍調(diào)到50，吸50ul重組人纖連蛋白加入到T25培養(yǎng)瓶中，加完之后要混勻鋪滿整個瓶子底部 ；包被時間:過夜(12-16h)，至少也需 37℃,2h 以上。

注意事項：細胞復蘇或傳代之前培養(yǎng)瓶需提前2小時包被。

2.HUVEC細胞解凍復蘇

1、提前室溫平衡人臍靜脈內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基。

2、準備一個包被好的培養(yǎng)瓶,把剩余包被液吸盡后加入5ml的dpbs 清洗一遍倒掉,再添加 5ml 室溫平衡專用培養(yǎng)基，同時準備一個15mL離心管,添加5ml含10%血清的其他培養(yǎng)基(用于離心）。

3、將凍存管快速在37℃水浴槽中解凍HUVEC細胞,至細胞全部融化(請在1-2分鐘內(nèi)完成)。

4、立即取出凍存管75%乙醇擦拭消毒凍存管表面，轉(zhuǎn)移至生物安全柜，將細胞懸液加入到提前準備好的離心管里。

5、在室溫，200g(1000rpm)離心5min。

6、棄去上清 ,用手指彈松細胞沉淀 ,添加 2ml專用培養(yǎng)基重新懸浮細胞后，接種至1個T25培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶中總共完培5-7ml。“畫8字法”使細胞均勻分布。

7、在 37℃、5%CO2 和 95%空氣條件下進行細胞培養(yǎng),透氣瓶可直接放入培養(yǎng)箱，非透氣請擰松放入培養(yǎng)箱。

8、在復蘇后第二天16h后可觀察貼壁情況,有少量漂浮可以不用換液,約3-4天可進行傳代。
3.HUVEC傳代：

注意：當HUVEC細胞密度達到85%-95%時，即可進行傳代。

1、棄去培養(yǎng)液,用 PBS 洗滌 1-2次;

2、將 Trypsin-EDTA.(0.05%)(語純生物貨號:YC-5004)、 huvec細胞培養(yǎng)基（語純生物貨號：CC0122）、含 10%FBS 其它培養(yǎng)基(用于終止液)置于室溫平衡。

3、棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基,用 5ml 無鈣鎂離子 PBS 緩沖液(語純生物 貨號:YC-5013)清洗細胞層盡量去除液體后加入 1ml 的 0.05%胰酶消化液 37℃消化至細胞變圓,用手輕拍瓶尾成流沙樣脫落;脫落率約 80%。

4、此時,立即加入3-5ml其他完培培養(yǎng)基(含10%血清)終止消化,輕柔吹打瓶內(nèi)3-6下,將細胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管,200g(1000rpm)室溫離心5min;

5、棄上清，用手指彈松細胞細胞沉淀，加入新鮮專用培養(yǎng)基后視推薦傳代比例和細胞計數(shù)后進行接種若干新的T25培養(yǎng)瓶中;培養(yǎng)基t25添加5-7ml；

6、每2天更換一次培養(yǎng)基。