水之疾,至于漂石者,勢也”——《孫子兵法》。說只要速度足夠快,石頭就能漂在水面。上個月我們聊了一下降低退火變溫速率(PCR反應(yīng)程序優(yōu)化之緩)對PCR結(jié)果的優(yōu)化,今天換個方向,聊聊如何把PCR反應(yīng)時長進(jìn)行壓縮。
在聊壓縮時長之前,需先對試管(Tube)/模塊(Block)控溫;普通/快速模式幾個概念進(jìn)行簡介。下面以柏恒Q9606為圖例進(jìn)行說明。
圖1
模塊控溫:反應(yīng)升降溫時,以模塊的實(shí)時溫度為準(zhǔn)。
試管控溫:反應(yīng)升降溫時,以反應(yīng)管內(nèi)試劑的實(shí)時溫度為準(zhǔn)。
圖2
圖3
實(shí)驗(yàn)編輯完成后,點(diǎn)擊運(yùn)行按鈕會彈出提示框(如圖2),選擇快速模式還是普通模式。
以圖3程序?yàn)槔f明:
快速模式:儀器運(yùn)行的升降溫速率為8℃/s,標(biāo)示升降溫速率的全額運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。
普通模式:儀器運(yùn)行的升降溫速率為4℃/s,標(biāo)示升降溫速率的半額運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。
不同的應(yīng)用場景選擇不同的反應(yīng)模式組合,下面來分享一下如何調(diào)試快速試劑的反應(yīng)程序。
首先,儀器運(yùn)行設(shè)置選擇快速模式+模塊控溫的組合將反應(yīng)時長進(jìn)行壓縮。其次,在總時長不變的前提下合理分配循環(huán)段變性與退火延伸的時長。最后,在其次篩選出可用反應(yīng)程序的基礎(chǔ)上進(jìn)行微調(diào),再一次縮短反應(yīng)段的時長或在總時長允許的條件下適當(dāng)延長反應(yīng)段的時長以達(dá)到的反應(yīng)效果。
因?yàn)榭焖僭噭┧玫臄U(kuò)增酶相較于普通試劑的酶來說有著更為快速的延伸速度,所以在設(shè)置退火延伸段反應(yīng)時長時可以進(jìn)行大幅度的壓縮。在壓縮變性反應(yīng)時長時須注意,因?yàn)檫x用的是模塊控溫,如果變性時長過短會造成試劑的實(shí)際溫度不足95℃或95℃維持時長不夠而造成模板的解雙鏈不充分進(jìn)而影響信號的積累,所以變性反應(yīng)段的時長不宜過度。
柏恒Q9600系列可提供最快8℃/sec的升降溫速率,且具備等溫差梯度功能(如圖4),滿足常規(guī)試劑開發(fā)、檢測的同時也為快速試劑提供了一個很好的反應(yīng)平臺。
圖4
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