Piezo1 對抗與衰老相關的皮質骨丟失

Piezo1 opposes age-associated cortical bone loss

Keywords: Piezo1; age-associated bone loss; endocortical bone resorption; mechanical stimulation.

衰老會導致松質骨和皮質間隔的骨質流失。隨著年齡的增長，松質骨骨質丟失與骨形成減少和骨重塑率低有關。相比之下，與衰老相關的皮質骨骨質丟失主要是由于皮質內表面破骨細胞數(shù)量和骨吸收的增加。在皮質骨中，編碼RANKL（一種對破骨細胞形成至關重要的細胞因子）的腫瘤壞死因子配體超家族成員11（Tnfsf11）隨著年齡的增長而增加，RANKL的誘餌受體骨保護素（OPG）隨著年齡的增長而減少，證明了破骨細胞形成增加在年齡相關的皮質骨丟失中的重要性。

機械刺激，如來自身體活動的刺激，通過增加成骨細胞的數(shù)量和活性來促進骨骼形成。相反，機械刺激的缺失通過促進破骨細胞形成和骨吸收導致骨質流失。因此，成骨細胞和破骨細胞都受到機械刺激的調控。此外，骨骼對機械負荷的合成代謝反應隨著年齡的增長而減弱，表明老骨頭感知和/或轉導機械刺激的能力降低。這表明，機械刺激的減少會導致與年齡相關的骨質流失。

Piezo1 是一種機械敏感離子通道，能夠感應各種機械刺激，包括膜拉伸、基質剛度和流體剪切應力，并在許多器官的機械轉導中起重要作用。刪除成骨細胞系細胞中的 Piezo1 基因，證明了 Piezo1 在骨穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用。

基于此，美國阿肯色大學醫(yī)學院骨科及肌肉骨骼疾病研究中心團隊探討了 Piezo1 在成骨細胞譜系細胞中的表達是否在與年齡相關的骨質流失中起重要作用，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，成骨細胞系細胞中 Piezo1 缺失的小鼠比對照小鼠失去更多的皮質骨，這與皮質內表面破骨細胞數(shù)量的增加顯著相關。研究結果表明，Dmp1-Cre 靶細胞中的 Piezo1 表達對骨穩(wěn)態(tài)至關重要，并介導骨骼對機械刺激的反應。研究成果發(fā)表于 Aging Cell  期刊題為“Piezo1 opposes age-associated cortical bone loss”。

首先，為了確定 Piezo1 表達是否隨著年齡的增長而變化，比較了不同小鼠品系 6 月齡和 24 月齡小鼠脛骨皮質骨中的 Piezo1 表達，均發(fā)現(xiàn)其在 24 月齡小鼠皮質骨中的表達顯著降低。除小鼠外，還比較了年輕人和老年人受試者股骨頸皮質骨中 Piezo1 的表達，結果顯示，與年輕人相比，老年人的 Piezo1 表達也有類似的降低。為了進一步驗證這些發(fā)現(xiàn)，對小鼠和人類骨骼樣本進行了 RNAscope，發(fā)現(xiàn)老齡鼠股骨和老年人類股骨頸皮質骨中的 Piezo1 mRNA 降低，與基因表達分析一致。這證明，衰老與骨骼中 Piezo1 表達降低之間存在相關性，Piezo1 表達的降低可能在與年齡相關的骨骼變化中發(fā)揮作用。

為了確定成骨細胞系細胞中 Piezo1 的表達是否在與年齡相關的骨質流失中發(fā)揮作用，構建 Dmp1-Cre 轉基因靶細胞 Piezo1 條件性敲除小鼠（Dmp1‐Cre; Piezo1f/f）。正如預期，與 6 月齡小鼠相比，對照小鼠在 24 月齡時表現(xiàn)出與年齡相關的松質骨丟失，相比之下，條件性敲除小鼠在年輕時松質骨骨量低于對照組，但不會隨著年齡的增長而進一步丟失（圖1 a）。股骨皮質骨分析顯示，對照小鼠在 24 月齡時比 6 月齡的皮質厚度更低（圖1 b）。有趣的是，老齡條件性敲除小鼠與對照小鼠相比，皮質厚度隨著年齡的增長而下降更嚴重（圖1 b）。與此一致，24 月齡的條件性敲除小鼠表現(xiàn)出自發(fā)性脛骨骨折，而在年輕小鼠或老齡對照組中均未觀察到骨折（圖1 c）。這些結果表明，即使從較低的皮質厚度開始，成骨細胞和骨細胞中缺失 Piezo1 的小鼠也會隨著年齡的增長而失去更多的皮質骨。

為了確定皮質骨丟失的部位，測量了股骨中軸的骨膜和骨內膜周長。顯微 CT 分析顯示，對照小鼠的骨膜周長隨著年齡的增長而增加，成年條件性敲除小鼠與對照小鼠相比，小鼠的骨膜周長隨年齡的增長表現(xiàn)出明顯的增加（圖1 d）。在對照組和條件性敲除組中，骨內膜周長均增加，但條件性敲除小鼠的這種增加大于對照小鼠（圖1 e）。一致地，條件性敲除小鼠在股骨中軸測量的極慣性矩隨年齡的增加被減弱（圖1 f），且比對照小鼠產(chǎn)生更多的皮質孔隙（圖1 g、h）。這些結果表明，Dmp1-Cre 靶向細胞中的 Piezo1 缺失增加了老齡小鼠的皮質內擴張和皮質骨孔隙率，說明條件性敲除小鼠皮質骨隨著年齡的增長而丟失更多是由于皮層內骨吸收的增加。

圖1    隨著年齡的增長，成骨細胞和骨細胞中 Piezo1 的缺失加劇了皮質骨骨質流失。

接下來，為了了解骨骼表型的細胞基礎，測量了股骨皮質內表面的破骨細胞數(shù)量和表面。TRAP 染色顯示，在兩種基因型中，老齡小鼠的骨細胞數(shù)量和骨內膜表面都比年輕小鼠增多，且在條件性敲除小鼠中顯著升高（圖2 a、b）。為了確定骨細胞中 Piezo1 的缺失是否增強其支持破骨細胞形成的能力，敲低 MLO-Y4 細胞（一種骨細胞樣細胞系）中的 Piezo1，并在 M-CSF 存在下將這些細胞與骨髓衍生的巨噬細胞共培養(yǎng)。TRAP 染色顯示，與對照細胞相比，Piezo1 敲低細胞具有更強的支持破骨細胞形成的能力（圖2 c）。與染色一致，基因表達分析顯示 Piezo1 敲低培養(yǎng)物中破骨細胞標志基因增加，包括 CtsK 和 Acp5（圖2 d）。相比之下，使用Yoda1 激活 Piezo1 會抑制骨細胞支持破骨細胞形成的能力，表現(xiàn)為共培養(yǎng) 7 天后 Acp5 表達降低（圖2 e）。此外，在體外培養(yǎng)股骨皮質骨，并用 Yoda1 處理骨樣本 3 天，發(fā)現(xiàn) Yoda1 在股骨皮質骨離體器官培養(yǎng)中降低了 Acp5 的表達（圖2 f）。這些結果表明，成骨細胞和骨細胞中Piezo1 的缺失會促進皮質內表面破骨細胞的形成。

為了進一步了解 Piezo1 調節(jié)破骨細胞形成的機制，分析了已知在破骨細胞生成中起關鍵作用的基因的表達水平，包括 Piezo1 敲低 MLO-Y4 細胞中的 Tnfsf11 和 Tnfrsf11b。結果顯示，Tnfrsf11b 在 Piezo1 敲低細胞中的表達顯著降低，Yoda1 激活 Piezo1 導致 Tnfrsf11b 表達顯著增加。同時，對小鼠左脛骨施加 5500 N 軸向壓縮載荷（4Hz）促進了小鼠皮質骨中 Piezo1 的表達和 Tnfrsf11b 的表達。這些數(shù)據(jù)表明，Piezo1 通過刺激骨細胞中的 Tnfrsf11b 表達來控制破骨細胞的形成。

此外，Tnfrsf11b 表達隨著年齡的增長而降低，類似于老齡小鼠中的 Piezo1 表達。重要的是，與年輕小鼠相比，Yoda1 誘導的 Tnfrsf11b 的增加在老齡小鼠分離的骨細胞中顯著減弱。因此，Piezo1 的缺失可能會進一步降低老齡小鼠 Tnfrsf11b 的表達。為了確定 Piezo1 敲除小鼠中 Tnfrsf11b 的表達，進行 RNAscope 測量皮質骨中 Tnfrsf11b 的表達，發(fā)現(xiàn)在基因敲除小鼠中表達 Tnfrsf11b 的骨細胞百分比顯著下降。這些結果表明，Piezo1 通過上調 Tnfrsf11b 表達來控制破骨細胞的形成。

圖2    成骨細胞和骨細胞中 Piezo1 的缺失增加了皮質內表面破骨細胞的形成。

最后，為了研究 Piezo1 調節(jié) Tnfrsf11b 表達的機制，使用 MLO-Y4 細胞模型檢查了 Yoda1 誘導的 Tnfrsf11b 表達是否需要鈣內流，因為 Piezo1 是一個鈣允許離子通道，而 Yoda1 在 MLO-Y4 細胞中誘導鈣內流。在無鈣培養(yǎng)基中培養(yǎng) MLO-Y4 細胞，并用 Yoda1 處理，發(fā)現(xiàn) Yoda1 誘導的 Tnfrsf11b 表達在細胞外鈣不存在的情況下減弱（圖3 a）。用細胞內鈣螯合劑 BAPTA 處理 MLO-Y4 細胞，發(fā)現(xiàn) Yoda1 誘導的 Tnfrsf11b 表達在沒有游離細胞內鈣的情況下被阻斷（圖3 b）。

然后，研究了鈣調蛋白（CaM）（一種介導細胞內鈣信號傳導的鈣結合蛋白）對 Yoda1 誘導的 Tnfrsf11b 表達增加的影響。在氯化卡咪唑銨（CMZ，一種膜滲透性 CaM 拮抗劑）存在下用 Yoda1 處理細胞，發(fā)現(xiàn)CMZ 抑制了 Tnfrsf11b 表達的增加（圖3 c）。因此，Ca2+ 和 CaM 是響應 Piezo1 激活而增加 Tnfrsf11b 表達所必需的。

Ca2+/CaM 已被證明可調節(jié)各種信號通路，包括 p38/MAPK、MEK/ERK、eNOS 和 mTOR 信號。此外，Piezo1 已被證明可調節(jié)內皮細胞中的 p38、eNOS 和 mTOR 信號。因此，利用這些通路的抑制劑來確定它們是否是 Piezo1 誘導的 Tnfrsf11b 表達所必需的。結果顯示，mTOR 抑制劑 PP242 阻斷了 Yoda1 誘導的 Tnfrsf11b 表達（圖3 d）。其他通路抑制劑包括 SB203590（p38/MAPK 抑制劑）、PD98059（MEK/ERK 抑制劑）和 L-NAME（eNOS 抑制劑）不影響 Piezo1 激活誘導的 Tnfrsf11b 表達的增加 （圖3 e）。這些結果表明，Piezo1 通過 Ca2+/CaM/mTOR 信號通路控制 Tnfrsf11b 的表達（圖3 f）。

圖3     Piezo1通過Ca2+/CaM/mTOR信號通路控制Tnfrsf11b的表達。

圖4    圖形概要

總之，該研究結果表明，機械負荷主要促進幼齡生長小鼠皮質骨的骨形成，導致骨量和骨大小增加。然而，在老齡小鼠中，機械負荷主要抑制骨吸收并防止皮質變薄和多孔隙。與此一致的是，隨著小鼠年齡的增長，Piezo1 的作用從促進骨形成轉變?yōu)橐种乒俏?。這些發(fā)現(xiàn)揭示了與年齡相關的骨質流失的復雜機制，并強調了機械刺激在衰老過程中保持骨骼完整性的重要性，為預防與衰老相關的骨骼疾病的治療策略提供借鑒。

參考文獻：Li X, Zhang C, Bowman HH, Stambough JB, Stronach BM, Mears SC, Barnes LC, Ambrogini E, Xiong J. Piezo1 opposes age-associated cortical bone loss. Aging Cell. 2023 Jun;22(6):e13846. doi: 10.1111/acel.13846. Epub 2023 May 5. PMID: 37147884; PMCID: PMC10265162.

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