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ELISA實(shí)驗(yàn)的核心三要素:不可-或缺的三大試劑

來(lái)源:上海滬鼎生物科技有限公司   2025年06月24日 15:19  

一、ELISA基本原理

ELISA通過抗原-抗體的特異性結(jié)合,利用酶催化底物顯色反應(yīng)進(jìn)行定量或定性分析。常見的類型包括直接法、夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法,但其核心步驟均依賴于以下三類關(guān)鍵試劑:

 

二、核心試劑一:包被抗體/抗原——實(shí)驗(yàn)的“基石”?

作用?:作為固相載體(微孔板)的固定化分子,捕獲目標(biāo)物。

選擇要點(diǎn)?:

純度與活性?:高純度避免交叉反應(yīng),確保結(jié)合效率(建議使用單克隆抗體)。

包被濃度優(yōu)化?:預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳濃度(通常1-10 μg/mL),濃度過高易導(dǎo)致空間位阻。

緩沖液選擇?:碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)常用,避免含BSA或Tween的溶液。

 

常見問題?:

非特異性結(jié)合?:增加封閉步驟(如5%脫脂牛奶或BSA封閉1小時(shí))。

包被不均?:4℃過夜包被優(yōu)于室溫2小時(shí),提高結(jié)合穩(wěn)定性。

 

三、核心試劑二:酶標(biāo)抗體——信號(hào)的“放大器”?

作用?:與目標(biāo)物結(jié)合后催化底物顯色,將生物學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號(hào)。

 

酶的種類?:

HRP(辣根過氧化物酶)?:常用,底物為TMB(顯藍(lán)色)或OPD(顯黃色),靈敏度高。

AP(堿性磷酸酶)?:底物為pNPP(顯黃色),適用于磷酸鹽緩沖體系。

標(biāo)記效價(jià)?:高效價(jià)減少用量,降低成本(建議效價(jià)≥1:5000)。

保存條件?:HRP需避光保存,避免反復(fù)凍融(分裝后-20℃儲(chǔ)存)。


注意事項(xiàng)?:

避免與疊氮鈉(HRP抑制劑)共用,可選擇ProClin 300作為防腐劑。


四、核心試劑三:底物顯色系統(tǒng)——結(jié)果的“可視化”?

作用?:酶催化底物生成有色產(chǎn)物,通過吸光度值定量目標(biāo)物濃度。

常用底物對(duì)比?:

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優(yōu)化技巧?:

顯色時(shí)間控制:室溫避光反應(yīng)10-30分鐘,避免過度顯色導(dǎo)致背景升高。

終止時(shí)機(jī):當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品最高濃度孔顯色明顯時(shí)立即終止。

 

五、實(shí)驗(yàn)流程關(guān)鍵步驟?

包被?:100 μL/孔,4℃過夜。

封閉?:含1% BSA的PBS,37℃ 1小時(shí)。

加樣?:樣本梯度稀釋,37℃孵育1小時(shí)。

酶標(biāo)抗體孵育?:37℃ 1小時(shí),洗滌3次(0.05% Tween-20 PBS)。

顯色與終止?:TMB顯色15分鐘,2M H?SO?終止。

讀數(shù)?:雙波長(zhǎng)檢測(cè)(450 nm/630 nm校正孔間誤差)。

 

六、常見問題與解決方案?

高背景噪音?:增加洗滌次數(shù)(5次以上),檢查封閉液是否失效。

低信號(hào)值?:優(yōu)化包被濃度或延長(zhǎng)底物孵育時(shí)間。

孔間差異大?:使用多通道移液器,確保加樣一致性。

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