聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR）技術(shù)循環(huán)檢測(cè)方法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一種用于擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。其核心原理是模擬生物體內(nèi)的DNA復(fù)制過(guò)程，通過(guò)特定的引物、DNA聚合酶和dNTPs（脫氧核糖核苷酸）來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA序列的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。

PCR技術(shù)的實(shí)現(xiàn)依賴(lài)于三個(gè)關(guān)鍵步驟的循環(huán)進(jìn)行：

一、變性（Denaturation）：在高溫（通常90-96℃）下，雙鏈DNA模板中的氫鍵斷裂，導(dǎo)致雙鏈分開(kāi)為兩條單鏈。這是擴(kuò)增過(guò)程中的第一步，也是將模板DNA變成單鏈狀態(tài)的過(guò)程。

二、退火（Annealing）：溫度降低（通常50-65℃）后，引物與單鏈DNA模板上互補(bǔ)的序列結(jié)合。引物是短的DNA序列，設(shè)計(jì)用于與目標(biāo)DNA片段的兩端特定區(qū)域互補(bǔ)，從而引導(dǎo)后續(xù)的合成過(guò)程

三、延伸（Extension）：在中溫（通常72℃左右）下，Taq DNA聚合酶（一種耐熱DNA聚合酶）作用于引物-模板復(fù)合物，沿著模板DNA合成新的互補(bǔ)鏈。這個(gè)過(guò)程中，dNTPs被聚合到引物的3'端，形成新的DNA鏈，直至達(dá)到模板的末端。

這三個(gè)步驟組成一個(gè)循環(huán)，每完成一個(gè)循環(huán)，目標(biāo)DNA片段的數(shù)量理論上增加一倍。通過(guò)25-35個(gè)循環(huán)，可以將目標(biāo)DNA序列擴(kuò)增至數(shù)百萬(wàn)倍，從而達(dá)到可以檢測(cè)的水平。

PCR技術(shù)的檢測(cè)方法主要依賴(lài)于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，傳統(tǒng)的PCR通常通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物。隨著技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和數(shù)字PCR（Digital PCR, dPCR）等更為先進(jìn)的檢測(cè)方法。

一、傳統(tǒng)PCR檢測(cè)：

瓊脂糖凝膠電泳：擴(kuò)增后的DNA片段通過(guò)電泳分離，根據(jù)其大小在凝膠上形成條帶，通過(guò)觀察條帶的出現(xiàn)與否來(lái)判斷擴(kuò)增是否成功。

二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）：

熒光染料法：使用SYBR Green I等染料，其能嵌入雙鏈DNA中并在熒光下發(fā)光，隨著PCR循環(huán)的進(jìn)行，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度來(lái)定量目標(biāo)DNA。

探針?lè)ǎ?/span>采用TaqMan探針等熒光標(biāo)記探針，探針與目標(biāo)序列結(jié)合后被DNA聚合酶酶切，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，釋放熒光信號(hào)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化來(lái)定量目標(biāo)DNA。

三、數(shù)字PCR（dPCR）：

油包水液滴式數(shù)字PCR（ddPCR）：將樣本分成數(shù)萬(wàn)個(gè)獨(dú)立的微滴（液滴），每個(gè)微滴中包含少量的DNA模板。通過(guò)PCR擴(kuò)增后，檢測(cè)每個(gè)微滴中的熒光信號(hào)，陽(yáng)性信號(hào)表示微滴中含有目標(biāo)DNA，陰性信號(hào)則表示沒(méi)有。通過(guò)泊松分布計(jì)算，最終獲得目標(biāo)DNA的絕對(duì)定量結(jié)果。

數(shù)字PCR技術(shù)由于其不依賴(lài)標(biāo)準(zhǔn)曲線、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高（±10% copies/μL）和適合低豐度目標(biāo)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，已成為一種非常有潛力的核酸定量技術(shù)。與傳統(tǒng)qPCR相比，它在低拷貝數(shù)目標(biāo)檢測(cè)、拷貝數(shù)變異分析、稀有突變檢測(cè)等領(lǐng)域展現(xiàn)出有的優(yōu)勢(shì)。