IPS誘導(dǎo)肝類器官培養(yǎng)攻略

一、實驗準(zhǔn)備

1、hPSC誘導(dǎo)分化肝類器官試劑盒（abs90127-1kit）

產(chǎn)品組成：

2、輔助試劑

3、實驗耗材

 二、誘導(dǎo)流程圖

三、培養(yǎng)方法

1、hPSC 分化為內(nèi)胚層細(xì)胞（DE）（以6孔板2個孔為例）

（1）取5.938mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基1+60μL 補(bǔ)充劑A+2μL 補(bǔ)充劑B 配成DE 分化培養(yǎng)基①，可同時培養(yǎng)6 孔板的3個孔；
（2）基質(zhì)膠在4℃下解凍，與DMEM/F12 均勻混合，鋪板，備用。
（3）當(dāng)hiPSC 的匯合度達(dá)到75%-85%，吸去培養(yǎng)基，用2mL 1x 室溫PBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)清洗hiPSC，吸去PBS。
（4）加入1mL 的室溫hESC/iPSC Passage Solution（人多能干細(xì)胞消化液），轉(zhuǎn)移到37℃ 5% CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中5 min，使其解離成單細(xì)胞。
（5）5 min 后，吸去hESC/iPSC Passage Solution（人多能干細(xì)胞消化液），加入等體積的Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，并使用P-1000 吸頭輕輕上下吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，使用自動細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)細(xì)胞，使用臺盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞。將細(xì)胞單懸液收集到15mL 離心管中，室溫下300g 離心5 min。
（5）從基質(zhì)膠包被的板中小心地抽吸包被液而不損壞基質(zhì)膠涂層表面。
（6）離心結(jié)束，充分去除上清，用1mL DE 分化培養(yǎng)基①重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻。
（7）將細(xì)胞懸液以2.0 x10⁵個細(xì)胞/mL的濃度轉(zhuǎn)移到包被的孔中，加入1mL DE 分化培養(yǎng)基①，使孔中的體積達(dá)到2mL；
（8）24h 后（第1 天），13.86 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基1+140μL 補(bǔ)充劑A 配成DE 分化培養(yǎng)基②，可同時培養(yǎng)6 孔板的2個孔，吸去培養(yǎng)基，并加入2mL DE 分化培養(yǎng)基②，連續(xù)培養(yǎng)2 天，每24小時換一次液。
（9）第3 天換HS 培養(yǎng)基前可取一孔進(jìn)行內(nèi)胚層指標(biāo)檢測。

2、DE 誘導(dǎo)分化為肝特化譜系細(xì)胞(HS)（以6 孔板2 個孔為例）

（1）第3 天，將19.9 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基2 與100μL 補(bǔ)充劑C 充分混合，配制成HS 培養(yǎng)基，可同時培養(yǎng)6 孔板的2個孔，從培養(yǎng)物中抽吸培養(yǎng)基，在6 孔板中每孔用2 mL1x 室溫PBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)清洗培養(yǎng)物，然后從孔中移除PBS，每孔加入2 mL HS 培養(yǎng)基。
（2）將培養(yǎng)板放入37℃ 5%CO₂ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24h 更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)5 天。
（3） 第8 天埋膠前可取一孔進(jìn)行HS 指標(biāo)檢測。

3、HS 誘導(dǎo)分化為3D 肝類器官（以24 孔板6 個孔為例）

（1）第8 天，將194.1mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基3+5.9mL 補(bǔ)充劑充分混合，配制成3D 肝類器官培養(yǎng)基，分裝保存。
（2）在冰上解凍基質(zhì)膠，并將移液器吸頭提前置于-20℃冰箱中。
（3）吸出HS 培養(yǎng)基，用2mL1x 室溫PBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)洗滌1 次。
（4）加入含10μM Y-27632 的室溫hESC/iPSC Passage Solution（人多能干細(xì)胞消化液） 并在37℃、5% CO₂ 培養(yǎng)箱中孵育5 min；5 min 后吸去hESC/iPSC Passage Solution（人多能干細(xì)胞消化液），每孔加入1mL 恢復(fù)室溫的DMEM/F12（含10μM Y-27632），輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞脫離孔底。
（5）使用自動細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)細(xì)胞，使用臺盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞。
（6）將細(xì)胞懸液收集到15 mL 離心管中，室溫下300 g 離心5 min，吸出培養(yǎng)基并將細(xì)胞重懸于冷基質(zhì)膠中，以3000-10000 個細(xì)胞/孔的密度包埋在30-50μL 基質(zhì)膠中，將基質(zhì)膠與細(xì)胞一起置于冰上。
（7）將200μL 基質(zhì)膠/細(xì)胞混合物按每孔30μL 接種到24 孔板中。
（8）將板置于37℃、5%CO₂ 培養(yǎng)箱中20-30 分鐘使基質(zhì)膠凝固。
（9）每孔加入700μL 3D 肝類器官培養(yǎng)基進(jìn)行長期培養(yǎng)，每隔一天更換培養(yǎng)基，7-10 天傳代。

4、3D 肝類器官傳代

（1）取出冷凍的基質(zhì)膠置于4℃解凍，并提前將槍頭放置在-20℃預(yù)冷1h；
（2）吸除培養(yǎng)基，加入1mL 預(yù)冷的PBS 溶解基質(zhì)膠，將混合液轉(zhuǎn)移到1.5mL EP 管中，300g離心5min，去除上層的PBS 和基質(zhì)膠；
（3）加入1mL 類器官傳代消化液，吹打5-8 次，使類器官與類器官傳代消化液充分接觸，接著轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中，靜置解離5min；
（4）5min 后取出EP 管，300g 離心5min，去除上清，再加入1ml DMEM/F12，吹打孔中混合物40-50 次，使類器官團(tuán)徹di解離成單細(xì)胞，離心，去上清；
（5）用預(yù)冷槍頭按每孔30μL 的量在離心管中加入適量的基質(zhì)膠，吹打5-8 次，均勻混合單細(xì)胞-基質(zhì)膠，注意吹打過程中避免產(chǎn)生氣泡；
（6）將提前放在培養(yǎng)箱中的24 孔板取出，在孔中心位置加入30μL 膠滴，緩慢打入混合液時，逐漸向上移動槍頭，使細(xì)胞均勻分布在膠中；
（7）將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中，20-30min，使膠滴凝固；
（8）小心沿孔壁加入700μL 恢復(fù)室溫的3D 肝類器官培養(yǎng)基，注意不要碰到膠滴；
（9）將孔板放到培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1 天換液一次（可周一、周三、周五換液，周五可添加至800μL，周六、周日不換液），1 周左右傳代一次。

（10）肝類器官成熟后可進(jìn)行染色鑒定或肝祖細(xì)胞/肝干細(xì)胞檢測。