剪切應(yīng)力通過 p38 通路調(diào)控人牙髓干細(xì)胞的成骨分化

Shear Stress Regulates Osteogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells via the p38 Pathway

Keywords: human dental pulp stem cells, shear stress, osteogenesis

再生骨療法在牙科的種植體植入和美觀治療中應(yīng)用廣泛，但拔牙后的牙槽嵴吸收及移植物吸收等問題仍待解決，且現(xiàn)有方法受個體條件限制?；诟杉?xì)胞的組織工程是牙槽骨增量的重要替代方案，其中間充質(zhì)干細(xì)胞與間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSCs）可分化為多種功能細(xì)胞，存在于多種組織中。人牙髓干細(xì)胞（hDPSCs）具備多能性，可從恒牙的牙髓組織中獲取，在牙本質(zhì)和骨形成方面有潛力，是高效牙槽骨增量的潛在來源。此外，機(jī)械刺激能促進(jìn)干細(xì)胞骨分化，有研究顯示剪切應(yīng)力對源自 hDPSCs 的成骨樣細(xì)胞有影響，hDPSCs 在礦化條件下會對脈動流體剪切應(yīng)力產(chǎn)生響應(yīng)。

hDPSCs 對機(jī)械刺激高度敏感，多種機(jī)械刺激可調(diào)控其增殖與成骨分化。低強(qiáng)度脈沖超聲（LIPUS）能誘導(dǎo)其增殖，周期性機(jī)械張力可提升成骨標(biāo)志物表達(dá)，脈動液流（PFF）、靜態(tài)拉伸應(yīng)變及微納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等則通過提高 NO、PGE2、COX-2 水平增強(qiáng)成骨活性，且這些過程多由 Piezo-1/2 蛋白等機(jī)械敏感通道經(jīng) ERK 1/2 MAPK 信號通路介導(dǎo)。不過，剪切應(yīng)力雖能促進(jìn)其他骨相關(guān)細(xì)胞的成骨分化，但其誘導(dǎo) hDPSCs 成骨分化的機(jī)制尚未明確。

基于此，泰國朱拉隆功大學(xué)牙科學(xué)院的團(tuán)隊(duì)為了探究剪切應(yīng)力對 hDPSCs 成骨分化的影響及潛在機(jī)制，提出了特定剪切應(yīng)力可增強(qiáng) hDPSCs 成骨分化的假設(shè)。研究成果發(fā)表在International journal of molecular sciences 雜志，題為“Shear Stress Regulates Osteogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells via the p38 Pathway”。

首先，為了評估剪切應(yīng)力在 hDPSCs 成骨分化中的作用，研究人員在施加剪切應(yīng)力 24 小時后，將 hDPSCs 在成骨培養(yǎng)基（OM）中額外培養(yǎng) 21 天。結(jié)果顯示，剪切應(yīng)力可顯著上調(diào)不同培養(yǎng)階段（7 天、14 天、21 天）的成骨相關(guān)基因（如 RUNX2、OSX、ALP、COL1A1、OCN、OPN）表達(dá)（圖 1A），且 14 天時成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（OSX）的蛋白表達(dá)在剪切應(yīng)力組中顯著高于靜態(tài)對照組（圖 1B-D），而普通生長培養(yǎng)基（GM）中的靜態(tài)培養(yǎng)組未檢測到 OSX 表達(dá)（圖 1B）。這表明剪切應(yīng)力能促進(jìn) hDPSCs 的成骨分化。

圖1     施加剪切應(yīng)力可促進(jìn) hDPSCs 的成骨分化。

接著，研究人員為了探究剪切應(yīng)力對成骨誘導(dǎo)的 hDPSCs 礦化過程的作用，通過在成骨誘導(dǎo)的第 7、14、21 天采用 ALP 染色和 ARS 染色進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作為早期成骨標(biāo)志物的 ALP，其染色強(qiáng)度在剪切應(yīng)力組的第 14 和 21 天顯著增強(qiáng)（圖 2A）。靜態(tài)對照組的細(xì)胞生長區(qū)域雖有礦化，但剪切應(yīng)力組在第 14 和 21 天的礦化程度更明顯（圖 2B），且 ARS 染色的定量結(jié)果證實(shí)，剪切應(yīng)力可顯著促進(jìn)成骨誘導(dǎo)的 hDPSCs 礦化（圖 2C）。這表明剪切應(yīng)力能推動成骨誘導(dǎo)的 hDPSCs 發(fā)生礦化。

圖2     剪切應(yīng)力促進(jìn)了 hDPSCs 的堿性磷酸酶活性及礦化作用。

接下來，研究人員通過 RNA 測序等方法探究了剪切應(yīng)力作用后 hDPSCs 成骨分化相關(guān)的信號通路。結(jié)果顯示，剪切應(yīng)力處理使 19 個基因上調(diào)、26 個基因下調(diào)（圖 3A）。其中 CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 δ（CEBPD）的表達(dá)被顯著上調(diào)（圖 3B-C）。KEGG 通路富集分析表明 MAPK 信號通路參與了該過程，涉及 11 個上調(diào)和 7 個下調(diào)的差異表達(dá)基因（圖 3D）。

圖3     施加剪切應(yīng)力 24 h后 hDPSCs 的 DEGs 鑒定。

最后，研究人員探究了剪切應(yīng)力誘導(dǎo) hDPSCs 成骨分化的具體機(jī)制。在施加應(yīng)力前，先用 p38 抑制劑（SB203580）處理 hDPSCs，隨后施加剪切應(yīng)力，再將細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng) 21 天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，剪切應(yīng)力可上調(diào)成骨標(biāo)志物基因（RUNX2、OSX、ALP、COL1A1 ）的 mRNA 表達(dá)（圖 4A），并增強(qiáng)細(xì)胞礦化與鈣化。而 p38 抑制劑能顯著阻斷上述成骨標(biāo)志物基因在 14 天和 21 天的上調(diào)（圖 4A），同時降低 14 天（圖 4B）和 21 天（圖 4C）的礦化與鈣化程度。這表明剪切應(yīng)力是通過 p38 MAPK 通路刺激 hDPSCs 成骨分化的。

圖4    p38 信號通路與 hDPSCs 中剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨分化相關(guān)。

圖5     p38 MAPK 通路參與剪切應(yīng)力增強(qiáng) hDPSCs 成骨分化的機(jī)制示意。  

總之，該研究表明了剪切應(yīng)力可以通過p38 MAPK信號通路增強(qiáng)hDPSC的成骨分化（圖5）。這些研究的結(jié)果有可能帶來改善骨骼修復(fù)和再生的創(chuàng)新方法。

參考文獻(xiàn)：Lwin HY, Tiskratok W, Kyawsoewin M, Manokawinchoke J, Termkwanchareon C, Limjeerajarus N, Limjeerajarus CN, Egusa H, Osathanon T, Limraksasin P. Shear Stress Regulates Osteogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells via the p38 Pathway. Int J Mol Sci. 2025 Jun 13;26(12):5667. doi: 10.3390/ijms26125667. PMID: 40565131; PMCID: PMC12193168.

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