人的白介素8（IL8）檢測試劑盒部分使用說明書

[預(yù)期應(yīng)用]

本試劑盒運用雙抗體夾心ELISA法定量測定人血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清 或其它相關(guān)生物液體中IL8含量。

[試劑盒內(nèi)容]

[需自備的設(shè)備及試劑]

1、450±10nm濾光片的酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）

2、單道或多道微量加液器及吸頭

3、稀釋樣品的EP管

4、蒸餾水或去離子水

5、吸水紙

6、盛放洗液的容器

[操作步驟]

1、 加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔，依次加入100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（見試劑準(zhǔn)備2）?？瞻卓准?span lang="EN-US">100μL（見試劑準(zhǔn)備第二步zui后一管），余孔加待測樣品100μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37^oC溫育2小時。

2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。

3、 每孔加檢測溶液A工作液100μL（臨用前配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37^oC溫育1小時。

4、 棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干），重復(fù)洗板3次。zui后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液*甩干。自動洗板機亦可。

5、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100μL，加上覆膜，37^oC溫育30分鐘。

6、 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4。

7、 每孔加底物溶液90μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37^oC避光顯色（反應(yīng)時間控制在15-25分鐘，不要超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）。

8、 每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請輕輕晃動酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。

9、 在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度（O.D.值）。

注意：

1、 試劑準(zhǔn)備：準(zhǔn)備一次實驗所需要的酶標(biāo)條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。

2、 加樣：實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時注意不要有氣泡，將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。因此，一次加樣時間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實驗。

3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)，同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時間和溫度。

4、 洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液*甩干。洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實 驗過程中。

5、 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘觀察一次），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

6、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7、 如果實驗室內(nèi)濕度低于60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。

[實驗原理]

將IL8抗體包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本，其中的IL8與連接于固相載體上的抗體結(jié)合，然后加入生物素化的IL8抗體，將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后，加入HRP標(biāo)記的親和素，再次*洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL8呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（O.D.值），計算樣品濃度。

[計算]

各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本O.D.值扣除空白孔O.D.值后作圖（七點圖），如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（或?qū)?shù)坐標(biāo)），O.D.值為橫坐標(biāo)（或?qū)?shù)坐標(biāo)），繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線（*方程式應(yīng)依回歸方程計算的R²值來定，以R²值越趨近于1為好）。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curve expert 1.30，根據(jù)樣品O.D.值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與O.D.值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的       O.D.值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

[檢測范圍]

15.6pg/mL-1,000pg/mL

[zui低檢測限]

6.4pg/mL

此值為20個空白樣品（即標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液）測定的平均值加二倍標(biāo)準(zhǔn)差所對應(yīng)的濃度。

[穩(wěn)定性]

經(jīng)測定，試劑盒在有效期內(nèi)按推薦溫度保存，其活性降低率小于5%。

試劑盒穩(wěn)定性由加速破壞試驗測定。具體方法為：將試劑盒放置于37^oC破壞3天后重新測定其各項指標(biāo)，并比較破壞前后的測定值。（參考《中國生物制品規(guī)程》，生物試劑在37^oC每穩(wěn)定一天，相當(dāng)于4^oC保存2個月）。

注意：

為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響，實驗室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實驗室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實驗員來進(jìn)行操作可減少人為誤差。

[實驗流程]

1、實驗前標(biāo)準(zhǔn)品、試劑及樣本的準(zhǔn)備；

2、加樣（標(biāo)準(zhǔn)品及樣本）100μL，37^oC孵育2小時；

3、加檢測溶液A100μL，37^oC孵育1小時；

4、洗板3次；

5、加檢測溶液B100μL，37^oC孵育30分鐘；

6、洗板5次；

7、加TMB底物90μL，37^oC孵育15－25分鐘；

8、加終止液50μL，立即450nm讀數(shù)。

[說明]

1、 由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。

2、 zui終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。

3、 不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行實驗操作，電子版說明書僅作參考。

4、 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到*的檢測結(jié)果。

5、 在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。

6、 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。請勿提前將酶標(biāo)板從包裝袋里拿出。

7、 由于操作者不熟練、操作失誤或讀數(shù)儀程序選用錯誤等有可能會導(dǎo)致錯誤結(jié)果的產(chǎn)生。請使用者使用該產(chǎn)品前仔細(xì)閱讀說明書，調(diào)試好酶標(biāo)儀，請使用配備有450±10nm濾光片的酶標(biāo)儀，且該酶標(biāo)儀測量范圍在0.001-3.000 O.D.或以上。

對ELISA操作不熟悉的可以參照視頻

8、 同一使用者在使用同一產(chǎn)品時，如不同時間訂購，也可能會因不同批次的少量差異產(chǎn)生不同結(jié)果，因此建議使用者在每次使用前均進(jìn)行預(yù)實驗。

9、 試劑盒在出廠前均經(jīng)過嚴(yán)格檢測，但由于運輸條件及各實驗室條件差異，可能會造成實驗結(jié)果與出廠結(jié)果不一致或不同批次試劑盒批間差大的情況，Uscn,Inc.會根據(jù)實際情況酌情處理。

10、本試劑盒未與其他廠家同類試劑盒或不同方法檢測同一目的蛋白的產(chǎn)品做對比，平行檢測可能會存在檢測結(jié)果不一致的情況。

11、本試劑盒有效期：六個月。

12、本操作說明同樣適用于48T試劑盒，但48T試劑盒所有試劑減半。

[警告]

本試劑盒中使用了稀硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時應(yīng)避免接觸衣物或眼、手等皮膚暴露部位。