常用包埋劑選擇指南

常用包埋劑選擇指南   

    我們在實驗中需要各種各樣的包埋劑：石蠟、樹脂等等，哪種適合自己呢？剛開始進入實驗室的同學(xué)會有些茫然，這里我向大家推薦一些包埋劑的選擇方法。

   我們就從簡單的說起，根據(jù)自己的研究目標(biāo)物需要切多厚的片子和自己實驗室的常規(guī)設(shè)備來決定用電鏡還是光鏡解決問題。切記，光鏡即可判定的問題就用光鏡，快速且容易掌握，利于問題的解決，何樂而不為呢，節(jié)約時間和金錢，這才是主要的。光鏡常用什么包埋劑呢，石蠟！石蠟到處都有售賣，經(jīng)濟又實惠，普通的切片*的了。但是如果石蠟解決不了我的問題，我需要更的研究，或者我的樣本根本不能用石蠟包埋，我需要低溫，我需要染色，我需要電鏡觀察，這怎么辦呢？

    樣本包埋的目的是什么，這是我們思考問題的基本出發(fā)點。樣本制備過程中的滲透和包埋的目的是使包埋劑逐步滲透入組織細胞內(nèi)，以便與細胞外的包埋劑同時聚合，保證能切出質(zhì)量優(yōu)良的超薄切片。光學(xué)顯微鏡觀察的切片一般是用石蠟包埋的，但電子顯微鏡觀察的切片比石蠟切片要薄得多，因此，石蠟不適宜做超薄切片。一般電鏡用的包埋劑應(yīng)具備如下的特點：

硬度適宜而且均一,有良好的切割性能，目前通用的包埋劑切割性能都很好。一般來說，Epon 812和非極性丙烯酸樹脂的切割性能要比低粘度的環(huán)氧樹脂（如Spurr等）以及極性丙烯酸樹脂（如Lowicryl K4M等）好。

能溶于脫水劑或滲透的過渡試劑，并且有足夠的低粘度，以保證能自由地滲入樣品

對樣品的傷害不大，聚合前后體積變化不大，環(huán)氧樹脂聚合前后體積變化不大，而丙烯酸樹脂收縮相對大一些（體積收縮15-20%）。

能經(jīng)受電子束轟擊

透明度好，高倍電鏡下不顯示本身任何微細結(jié)構(gòu)

毒性低，使用方便，但目前使用的包埋劑在聚合之前都有毒，操作時要注意。

    根據(jù)上述對包埋劑的要求，目前在電鏡技術(shù)上使用的包埋劑種類頗多，但普遍使用的是環(huán)氧樹脂，在免疫和細胞化學(xué)技術(shù)中普遍使用的則是丙烯酸樹脂。

    環(huán)氧樹脂的型號較多，常用Epon812，Spurr樹脂（ERL-4221）等。環(huán)氧樹脂包埋劑對細胞微細結(jié)構(gòu)有較好的保存性能，聚合后體積縮小較少，而且在真空中能經(jīng)受較長時間的轟擊。但它的操作不太方便，反差較弱。

    丙烯酸樹脂無色透明的，由丙烯酸衍生物聚合而成。丙烯酸單體粘度低，可以在低溫下滲透及聚合，因而能滿足免疫和細胞化學(xué)技術(shù)低溫操作的要求。其聚合方式有兩種，熱聚合和紫外線照射聚合。但它對脂類等成分的抽提比環(huán)氧樹脂嚴(yán)重，為此它也需要在較低的溫度下使用才可能減少抽提作用。此外，聚合前后丙烯酸樹脂的體積變化較環(huán)氧樹脂大（體積大約收縮10-20%），并且它在電子束的照射下穩(wěn)定性比環(huán)氧樹脂低，放熱的聚合過程可引起組織細胞結(jié)構(gòu)的損傷，致敏性也比環(huán)氧樹脂強，使用時要小心防護。一般來說，除了免疫和細胞化學(xué)技術(shù)外，超微結(jié)構(gòu)的研究并不推薦使用它。在電鏡中使用較多的丙烯酸樹脂有倫敦白膠（LR White）和Lowicryl系列的樹脂以及technovit系列樹脂。

1.冰凍切片包埋劑

    常規(guī)石蠟包埋切片，樣本需要作一系列技術(shù)處理，一般需化費24小時方可完成全部制片過程。醫(yī)院有時需要快速切片診斷，快速冰凍切片是目前常用的方法，其中就用到了冰凍切片包埋劑。冰凍切片包埋劑常見的是OCT冰凍切片包埋劑和TBS冰凍切片包埋劑。對于需要完整包埋較大組織的研究人員來說，TBS包埋劑可能得到更好的切片質(zhì)量。

2.Epon812（Embed 812）包埋劑 

    Epon812（Embed 812）是一種進口樹脂，它是一種長鏈的脂肪族環(huán)氧化合物，是目前上普遍采用的一種優(yōu)良包埋劑，常態(tài)粘度為150-210cP。該包埋劑的配制方法很多，但一般都按1961年Luft提出的配方進行。下述配方若改變A液和B液的比例則可調(diào)節(jié)聚合塊硬度，A液多則軟，B液多則硬。A:B=1:1的配方適用普通的應(yīng)用。通常冬天使用A:B=2:8；夏天使用A:B=1:9，可視組織的硬度和氣候不同選擇其比例。配制時可先分別配制A液和B液，然后將A液和B液按一定比例混合后，再加入1%-2%的加速劑（BDMA需要 2.5-3%，如用 DMP-30僅需 1.5-2%），邊加邊攪拌，使其充分混合。

    有人將EMbed 812，DDSA，MNA三種成分按一定比例直接混合使用。根據(jù)樣品塊的硬度推薦不同的配方，這些知識產(chǎn)品的說明書里面就有。你常見到“根據(jù)南方地區(qū)的氣候條件，可用下列配方”字樣，這說明812樹脂包埋時受到環(huán)境濕度和溫度的影響較大，這會給我們的實驗會帶來一些不確定的因素，習(xí)慣選擇812樹脂做包埋的的一般是些實驗老手，經(jīng)驗豐富，掌控力強，新手要多加小心。

3.Spurr（ERL-4221包埋劑）包埋劑

    這是1969年由Spurr推薦使用的包埋劑，所以也稱Spurr樹脂。它含有兩個環(huán)氧基，是一種低粘度（7-10cP）的環(huán)氧樹脂。由于具有粘度低的特點，所以近年來一些實驗室已開始使用它。其配方可按表中各種成分的比例，即可獲得不同性能的包埋塊。

    Spurr樹脂硬度可用DER-736的量來調(diào)節(jié)。配制時，先把前三種成分混合后，后才加入DMAE，但從開始到混合完成，達到淡黃色狀態(tài)需3-7天。此包埋劑在70C，一般8小時即可*聚合，用陳舊的包埋劑時，則聚合時間會減少。因Spurr樹脂嗜氧，聚合時不要加蓋。包埋劑是用新鮮配制，但為了方便，可預(yù)先配制好保存在低溫和防潮的環(huán)境中。Spurr樹脂與Embed812樹脂相比粘度低，操作方便，新手容易掌握一點，但毒性比Embed 812樹脂大，所以操作時要更加小心。

4.倫敦白膠（LR White） 

    倫敦白膠含有7種不同的丙烯酸單體和2種增塑劑，引發(fā)劑是BPO（dibenzoyl peroxide），其具體的配方和成分沒有報道。它的粘度低，滲透能力強，可用于較大的組織塊或致密的組織，由于它有一定的親水性，方便水性染料進入，染色效果佳，使用非常方便。倫敦白膠可以微溶于水，因而可以采用部分脫水方案，但不能使用丙酮作為脫水劑。氧氣會抑制聚合反應(yīng)的進行，因而聚合時要在模塊中注滿包埋劑并蓋緊蓋子。此外，倫敦白膠不能在-15C以下的溫度使用。為了方便運輸和儲存，通常出售未加BPO的中等硬度的倫敦白膠（uncatalysed LR White），這種試劑買回需要自己加入催化劑（9.9g催化劑/500gLR White）充分?jǐn)嚢璨⑹覝胤胖?4小時以上才能使用。充分混合的包埋劑同樣保存在4C中，一旦加入催化劑后，它的有效期便為12個月。

5.Lowicryl系列包埋劑 

    Lowicryl系列包埋劑是專為低溫（-20C以下）包埋設(shè)計的包埋劑。它有兩種類型：一種是極性樹脂，K4M（低滲透溫度為-30C，低聚合溫度為-50C}）和K11M（低滲透溫度為-60C，低聚合溫度為-60C）；另一種是非極性樹脂，HM20（低滲透溫度為-50C，低聚合溫度為-50C和HM23（低滲透溫度為-80C}，低聚合溫度為-80C}）。極性樹脂親水，使樣品保存在一個水性的環(huán)境中從而較少蛋白質(zhì)變性，且染色的效果較好。而非極性樹脂的切割性能比較好。兩種樹脂通常都在隔絕氧氣的情況下低溫紫外線照射聚合。Lowicryl系列包埋劑全部以試劑盒的形式出售，有詳細的說明書提供參考。

6.滲透和包埋的注意事項

包埋過程中，一切器材用品都要干凈、干燥 

配制包埋劑時，每加一種試劑都要充分?jǐn)嚢杈鶆颍⒈M量防止產(chǎn)生氣泡 

若用Epon包埋，還要控制室內(nèi)的濕度（相對濕度在60%左右），否則聚合不均勻，造成切片困難，甚至包埋*失敗

包埋塊要保存在干燥器內(nèi)，以防吸濕 

7.怎樣從得到的圖像來指導(dǎo)包埋劑選擇

滲透和包埋引起的圖象缺陷主要由不合適的包埋劑配方引起。不合適的包埋劑配方能產(chǎn)生細胞器皺縮、切片擠壓等缺陷。環(huán)氧樹脂的聚合一般需要一種次級的非環(huán)氧化分子（硬化劑）。硬化劑和樹脂的環(huán)氧基反應(yīng)形成鍵，使單體結(jié)合在一起。樹脂的環(huán)氧基和硬化劑的反應(yīng)基之間的比率決定了聚合鏈的長度，也決定了樹脂塊的切割性能。雖然切片的擠壓、顫痕和表面缺陷常受到超薄切片刀的質(zhì)量的影響。但優(yōu)化樹脂的配方，選擇合適的比例可以降低這種缺陷的形成。

一般來說，在選擇包埋劑配方時，應(yīng)選擇與樣品的軟硬度相當(dāng)?shù)呐浞?。組織或組織成分的腫脹也可能是包埋劑配方不當(dāng)引起的缺陷。如：當(dāng)切片從包埋塊中切下后浮于水表面時，含有組織成分的部分切片可能腫脹甚至在水面擴散開來。這種情況的出現(xiàn)，是樹脂不均勻地滲透組織，特別是樹脂各組分的分離，導(dǎo)致了聚合不*的樹脂微池。這樣，組織、細胞和細胞器等基于它們被滲透的情況，可能以不同的速率發(fā)生腫脹（或收縮），從而導(dǎo)致切片變形甚至解體。