WB過程中如何保證的蛋白轉(zhuǎn)印

在WB過程中從SDS-PAGE膠上轉(zhuǎn)移蛋白至膜上是非常關(guān)鍵的步驟！優(yōu)化轉(zhuǎn)移時(shí)間往往需要實(shí)驗(yàn)多次，下面就講幾條關(guān)于如何保證蛋白*轉(zhuǎn)移的小技巧，適合新手參考:

使用預(yù)染的marker 預(yù)染marker不僅能夠直觀的觀察到跑膠情況，而且在轉(zhuǎn)移過程中也是很好的工具，在完成印跡后觀察膜上的 marker ，看是否所有條帶都已經(jīng)轉(zhuǎn)移至膜上。

在轉(zhuǎn)印裝置中加兩塊膜 小分子量的蛋白轉(zhuǎn)移的比較快，而為保證大分子蛋白的轉(zhuǎn)印，長(zhǎng)時(shí)間的轉(zhuǎn)印可能使小分子蛋白透過膜，因此，可以加入兩塊膜，如果能在第二塊膜上檢測(cè)到小分子蛋白，說明轉(zhuǎn)印時(shí)間過長(zhǎng)。

在轉(zhuǎn)印后對(duì)膠染色 如果轉(zhuǎn)印時(shí)間不夠優(yōu)化，通過對(duì)膠染色，在膠上能夠觀察到未轉(zhuǎn)移*的蛋白，這種情況在轉(zhuǎn)印大分子蛋白是常見，使用銀染或者考馬斯亮藍(lán)的方法都可以。

二、Western blot轉(zhuǎn)印的優(yōu)化

從SDS凝膠中進(jìn)行Western蛋白轉(zhuǎn)印的優(yōu)化需要對(duì)一系列參數(shù)進(jìn)行考慮。目的是轉(zhuǎn)印所有凝膠上的蛋白并將其定量地轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)印膜上。進(jìn)行轉(zhuǎn)印需要一定程度的優(yōu)化，尤其是對(duì)于大分子量和小分子量蛋白。

轉(zhuǎn)印后，凝膠上應(yīng)不殘留或殘留很少的蛋白?？梢栽谵D(zhuǎn)印后進(jìn)行染色進(jìn)行檢測(cè)。轉(zhuǎn)移出凝膠的蛋白應(yīng)該僅在接觸凝膠的膜的一面可見。如果有懷疑，在轉(zhuǎn)印時(shí)使用第二個(gè)”支持膜”，你可以在轉(zhuǎn)膜后染色，以檢查是否有穿膜的跡象。如果發(fā)現(xiàn)蛋白殘留在凝膠上而且膜的結(jié)合性很差，可以考慮下列因素：

SDS vs 甲醇

在多數(shù)轉(zhuǎn)印實(shí)驗(yàn)步驟中都使用SDS和甲醇。但兩者對(duì)于成功的轉(zhuǎn)印有相反的作用，需要根據(jù)欲轉(zhuǎn)印蛋白的性質(zhì)加以優(yōu)化。

SDS對(duì)于蛋白的遷移是必要的，尤其有助于大分子量蛋白從凝膠上的轉(zhuǎn)移。但由于膜結(jié)合需要疏水相互作用，SDS過多會(huì)抑制結(jié)合，尤其對(duì)于硝酸纖維素膜。作為一個(gè)一般性的規(guī)則，如果膜的結(jié)合力有效，但蛋白仍舊殘留在凝膠上，在轉(zhuǎn)印緩沖液中加入 0.1％SDS會(huì)促進(jìn)*轉(zhuǎn)印。但另一方面，甲醇通過在蛋白上剝離SDS，促進(jìn)蛋白和膜的疏水結(jié)合。一般在轉(zhuǎn)印緩沖液中加入20％的甲醇會(huì)增加硝酸纖維素膜的結(jié)合能力。

凝膠濃度

丙烯酰胺濃度越低，蛋白越容易轉(zhuǎn)移下來。選擇可以分離蛋白的濃度zui低的凝膠。梯度膠適用于轉(zhuǎn)印一系列不同大小的蛋白，因?yàn)槟z的孔與不同大小的蛋白匹配良好。

凝膠厚度

蛋白比較易于從薄膠上轉(zhuǎn)移下來，所以如果上樣體積允許，使用1.0mm厚的膠取代1.5mm的膠。

電場(chǎng)（電壓×時(shí)間）

如果電壓過低而且轉(zhuǎn)印時(shí)間過短，部分蛋白會(huì)殘留在凝膠上。如果電壓過高，小蛋白會(huì)在結(jié)合到膜上前透膜而出。如果按建議的條件轉(zhuǎn)印后有蛋白殘留在膠上，增加電壓可能會(huì)有幫助，但不要超過5V。

膜的類型

蛋白結(jié)合到硝酸纖維素膜上主要通過疏水鍵。PVDF膜比硝酸纖維素膜更疏水，在轉(zhuǎn)印過程中結(jié)合蛋白更緊密，可以耐受更多的SDS。目前，PVDF膜一般比硝酸纖維素膜需要更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆忾]條件，其適用于蛋白印跡。尼龍膜通過疏水和靜電相互作用結(jié)合，其SDS耐受度甚至高于PVDF膜，但也需要更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆忾]條件，主要建議用于Northern和 Southern。