關(guān)于共聚焦您可能不知道的

傳統(tǒng)熒光顯微鏡使用熒光物質(zhì)標志細胞中的特定結(jié)構(gòu)，不僅圖像與背景的對比度增強，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光，大大提高了分辨率。但當所觀察的熒光標本稍厚時，傳統(tǒng)熒光顯微鏡一個難以克服的缺點就顯現(xiàn)出來：焦平面以外的熒光使得圖片模糊、發(fā)虛，對比度降低。

圖1. 共聚焦光路

 
       激光共聚焦顯微鏡恰恰是為解決這個問題應運而生，科學家在光路中放置一個Pinhole，利用這個Pinhole阻擋焦平面以外的熒光（如圖1），提高對比度！由于對比度的大大提升，使得通過共聚焦顯微鏡得到的圖像細節(jié)更加清晰，因此受到了各個領(lǐng)域研究者的廣泛青睞！
共聚焦利用Pinhole排除非焦平面光線干擾，提高圖像對比度的同時，我們往往忽略了一個問題，那就是：Pinhole實際上是削弱了熒光信號的（如圖2）！只不過共聚焦顯微鏡利用高功率的激光提供了更強能量的激發(fā)光以彌補Pinhole對熒光信號的削弱。

圖2. Pinhole對熒光信號的削弱作用

 
       對于固定細胞，高能量激發(fā)光的影響主要在對于熒光分子的光漂白作用。而對于活細胞不單單是光漂白作用會影響成像，更加嚴重的是高能激發(fā)光對于活細胞產(chǎn)生的光毒性可能干擾細胞的生理過程。
        zui后一點：共聚焦采用點成像的工作模式，成像速度慢，對于各種動態(tài)生理活動的觀察時間分辨率低。