蛋白磷酸化測(cè)定

蛋白磷酸化測(cè)定檢測(cè)技術(shù)服務(wù)詳情介紹

蛋白磷酸化是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，涉及許多細(xì)胞功能，如生長(zhǎng)、分裂、死亡和應(yīng)答等。磷酸化的蛋白在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。因此，研究蛋白磷酸化對(duì)于理解細(xì)胞生物學(xué)和疾病進(jìn)展是非常重要的。

圖1. 酸化定量蛋白組學(xué)分析流程

蛋白磷酸化的測(cè)定通常使用以下幾種方法：

1、放射性標(biāo)記法：

通常使用γ-32P ATP作為放射性磷酸供體，經(jīng)由蛋白激酶催化，使目標(biāo)蛋白進(jìn)行磷酸化。然后，通過(guò)放射性測(cè)定來(lái)檢測(cè)蛋白磷酸化的水平。

2、Western blotting：

利用對(duì)特定磷酸化位點(diǎn)有特異性的抗體進(jìn)行檢測(cè)。首先，蛋白樣品經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF或nitrocellulose膜上，之后用特異的磷酸化抗體進(jìn)行檢測(cè)。

圖2. Far-Western Blot分析

3、質(zhì)譜法：

通過(guò)蛋白或多肽的質(zhì)譜分析，可以jīngquè地確定蛋白磷酸化的位點(diǎn)和程度。常用的技術(shù)包括液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）。

4、Phos-tag凝膠電泳：

Phos-tag是一種能與磷酸化部位結(jié)合的化合物。在Phos-tag SDS-PAGE中，磷酸化的蛋白會(huì)在凝膠中移動(dòng)變慢，從而與非磷酸化的蛋白分離。

5、ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法）：

利用磷酸化特異性抗體，可以構(gòu)建ELISA實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定樣品中磷酸化蛋白的水平。

6、流式細(xì)胞儀：

利用磷特異性抗體和熒光標(biāo)記，可以通過(guò)流式細(xì)胞儀來(lái)分析單細(xì)胞水平上的蛋白磷酸化情況。

選擇蛋白磷酸化測(cè)定的方法時(shí)，需要考慮樣品的性質(zhì)、所需的敏感度和分辨率、可用的儀器設(shè)備以及實(shí)驗(yàn)的預(yù)期目標(biāo)。

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