【化工儀器網(wǎng) 項(xiàng)目成果】鏈霉菌是重要的工業(yè)微生物，可以生產(chǎn)蛋白、小分子藥物等高附加值產(chǎn)品。工業(yè)生產(chǎn)中，常用隨機(jī)誘變手段產(chǎn)生大量的鏈霉菌突變庫，但缺乏與之相適配的高通量篩選手段用以獲得目標(biāo)突變株。已報(bào)道的基于流式細(xì)胞分選的方法只能對鏈霉菌的原生質(zhì)體或孢子進(jìn)行篩選，由于抗生素等次級代謝產(chǎn)物多產(chǎn)生于菌絲發(fā)酵的平臺(tái)期，因而原生質(zhì)體或孢子均無法代表鏈霉菌的真實(shí)發(fā)酵狀態(tài)，并不適合次級代謝產(chǎn)物的篩選；流式細(xì)胞儀也無法篩選胞外產(chǎn)物信號，因此開發(fā)鏈霉菌高效培養(yǎng)、檢測和分選的高通量篩選技術(shù)具有重要意義。
 

　　中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員王猛帶領(lǐng)的高通量編輯與篩選平臺(tái)實(shí)驗(yàn)室，開發(fā)了基于液滴微流控的鏈霉菌高通量篩選技術(shù)。研究調(diào)整與優(yōu)化鏈霉菌孢子液滴包埋參數(shù)及菌株液滴分選參數(shù)，使鏈霉菌高通量篩選技術(shù)的檢測分選速度達(dá)到約每小時(shí)1萬個(gè)菌株，人工混庫的單輪分選富集率超過330倍。團(tuán)隊(duì)運(yùn)用該技術(shù)在啟動(dòng)子強(qiáng)度分析、啟動(dòng)子改造、分泌蛋白表達(dá)等方面進(jìn)行了測試應(yīng)用，對數(shù)十種內(nèi)源和異源啟動(dòng)子的分析表明，液滴微流控技術(shù)測定的啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度信號與傳統(tǒng)的酶標(biāo)板和顯微鏡熒光測定結(jié)果一致；從弱啟動(dòng)子ermE*p和強(qiáng)啟動(dòng)子gapdh(EL)p出發(fā)的啟動(dòng)子改造結(jié)果表明，采用液滴微流控篩選技術(shù)可以梯度改變啟動(dòng)子強(qiáng)度，有效獲得啟動(dòng)子增強(qiáng)或減弱的突變體，充實(shí)元件庫用于后續(xù)的代謝工程改造，基于弱啟動(dòng)子ermE*p改造及篩選，獲得相比野生型強(qiáng)度為133.5%、343.2%和347.9%的突變體；基于強(qiáng)啟動(dòng)子gapdh(EL)p改造及篩選，獲得強(qiáng)度為野生型10.1%、24.7%和94.6%的突變體；針對鏈霉菌胞外產(chǎn)物纖維素酶，應(yīng)用液滴微流控技術(shù)快速從隨機(jī)突變庫中篩選獲得纖維素酶產(chǎn)量分別為出發(fā)菌株169.2%至211.4%的多個(gè)高產(chǎn)菌株。
 

　　此外，研究表明，鏈霉菌從孢子出發(fā)可以在液滴中穩(wěn)定培養(yǎng)7天以上，完成萌發(fā)、分化、進(jìn)行各種生物合成直至走向衰亡的完整生命周期。這一特性使開發(fā)的基于液滴微流控的鏈霉菌高通量篩選平臺(tái)可以用于菌體生長早期對于啟動(dòng)子等調(diào)控元件的篩選，也可以用于生長中期對于胞內(nèi)、胞外目標(biāo)蛋白的篩選，且在次級代謝產(chǎn)物如抗生素等篩選方面具有應(yīng)用前景。
 

　　科研團(tuán)隊(duì)撰寫的博客發(fā)表在Nature Portfolio Bioengineering Community的專欄Behind the paper上，從形態(tài)學(xué)角度探討了液滴微流控篩選方法與絲狀微生物的適配性，為該平臺(tái)在更多絲狀微生物改造和篩選方面的應(yīng)用提供了新思路。
 

　　相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在Communications Biology上。研究工作得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、中科院重點(diǎn)項(xiàng)目及天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升行動(dòng)的支持。
 

基于液滴微流的鏈霉菌高通量篩選技術(shù)示意圖
 

不同啟動(dòng)子的強(qiáng)度分析比較圖：a、酶標(biāo)儀，b、液滴微流控，c、熒光顯微鏡