De Novo測序常見問題解析

De Novo測序常見問題解析檢測技術(shù)服務(wù)詳情介紹

在dànbáizhì組學(xué)與抗體研究中，De Novo測序技術(shù)以其不依賴數(shù)據(jù)庫、可還原完整蛋白序列的dútè優(yōu)勢，成為科研人員和生物醫(yī)藥企業(yè)的重要工具。尤其在抗體序列解析、古蛋白重建、新型抗原發(fā)現(xiàn)等場景下，De Novo幾乎是wéiyī可行的解決方案。然而，由于該技術(shù)涉及復(fù)雜的質(zhì)譜數(shù)據(jù)解讀與算法重建，許多科研人員在項目初期常常存在各種疑問。本文整理出在項目溝通中zuì常被問到的七大問題，并提供zhuānyè解析與建議。

Q1：De Novo測序到底能不能保證“100%準(zhǔn)確”？

答案：理論上不能，實際上可以非常接近。

De Novo測序依賴的是肽段的質(zhì)譜碎片圖譜，準(zhǔn)確性受限于：

（1）酶解覆蓋度

（2）MS/MS碎片質(zhì)量

（3）同位肽異構(gòu)體分辨能力

在理想條件下（多酶酶解、高分辨率儀器、人工校核），可實現(xiàn)95%以上的序列還原準(zhǔn)確率。CDR等關(guān)鍵區(qū)域通常會被重點覆蓋與校驗。百泰派克生物科技在項目中采用雙平臺并行+人工驗證+結(jié)構(gòu)建模輔助策略，確保提供的序列具備重組表達和功能復(fù)現(xiàn)能力。

Q2：必須使用純化蛋白樣本嗎？能不能從血清或細胞上清直接測？

答案：不是必須，但推薦盡量純化。

De Novo測序的前提是對目標(biāo)蛋白進行高質(zhì)量的酶解與碎片采集。在復(fù)雜背景下直接測定會引入大量干擾肽段，尤其是抗體中的輕鏈重鏈含量遠低于其他血漿蛋白（如白蛋白、免疫球蛋白家族成員）。

百泰派克生物科技可提供：

（1）蛋白A/G親和純化

（2）SDS-PAGE或SEC預(yù)純處理

（3）特異性抗體pull-down技術(shù)

以確保即使是從血清、組織液或低表達細胞中，也能獲得適用于De Novo測序的高純度樣本。

Q3：只要一臺高分辨率質(zhì)譜儀就能做De Novo了嗎？

答案：不止儀器，算法和經(jīng)驗同樣關(guān)鍵。

雖然Orbitrap、TOF等gāoduān儀器能提供jīngzhǔn的碎片信息，但De Novo真正的難點在于：

（1）多酶酶解策略設(shè)計

（2）片段重疊拼接邏輯

（3）近似肽段的錯配糾正

（4）數(shù)據(jù)后處理與人工干預(yù)能力

百泰派克使用自研算法融合主流軟件（PEAKS、pNovo、Novor等），結(jié)合人工審校機制+結(jié)構(gòu)模板匹配分析，實現(xiàn)從原始MS數(shù)據(jù)到可表達序列的完整轉(zhuǎn)化。

Q4：De Novo能不能識別dànbáizhì的翻譯后修飾（PTMs）？

答案：可以，但需要特別設(shè)計實驗流程。

常見的翻譯后修飾包括糖基化（N-型、O-型），磷酸化、甲基化、乙?；?，氧化、脫酰胺等。在De Novo測序中，修飾位點會影響碎片圖譜的質(zhì)量與解讀算法的判斷，因此需要：

（1）提前告知目標(biāo)修飾類型

（2）選用適當(dāng)?shù)母患呗裕ㄈ鏗ILIC、IMAC）

（3）啟用修飾搜索參數(shù)

Q5：CDR區(qū)這么關(guān)鍵，能確保100%還原嗎？

答案：CDR還原準(zhǔn)確性是核心評價標(biāo)準(zhǔn)。

抗體的互補決定區(qū)（CDR）是與抗原結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其序列高度多變，往往在公共數(shù)據(jù)庫中無匹配項，因此只能依賴De Novo重建。我們通常采用：

（1）多種酶組合（Trypsin + Chymotrypsin + GluC）

（2）酶解重復(fù)覆蓋

（3）CDR特異性富集算法

（4）與抗體結(jié)構(gòu)模板進行序列預(yù)測交叉驗證

從而實現(xiàn)對CDR的高準(zhǔn)確率識別與還原，在多數(shù)項目中可達到CDR區(qū)95%以上的覆蓋與100%功能還原。

Q6：如果我手頭只有10 µg蛋白，還能做De Novo嗎？

答案：可以，但建議>20 µg更穩(wěn)妥。

現(xiàn)代高靈敏度質(zhì)譜儀器已可在低樣本量條件下進行MS/MS采集，但：

• 樣本越少，酶解重復(fù)性與覆蓋度下降

• 特異性修飾或微量異構(gòu)體信息可能遺漏

百泰派克已建立低樣本量De Novo測序流程，支持：

* 10 µg起始量的全序列解析

• 特殊樣本的微量富集（如IP抗體）

• “多輪重復(fù) + 信息整合式解讀”策略

Q7：項目周期多久？我多久能拿到抗體完整序列？

答案：標(biāo)準(zhǔn)項目為3-4周，急件可加速至10個工作日。

項目周期受以下因素影響：

• 樣本復(fù)雜度（純化程度、修飾情況）

• 是否需要PTM圖譜、結(jié)構(gòu)建模等增值內(nèi)容

• 是否需重組表達與功能驗證

百泰派克生物科技提供多種項目優(yōu)先等級選擇，技術(shù)團隊支持從樣本接收、項目設(shè)計、數(shù)據(jù)解讀到下游表達一體化服務(wù)，確保您zuì快拿到可復(fù)現(xiàn)、可表達的抗體序列信息。

百泰派克生物科技：從De Novo到功能驗證的一站式服務(wù)平臺

作為質(zhì)譜驅(qū)動的抗體研究服務(wù)提供商，百泰派克生物科技已累計完成200+例高難度De Novo抗體測序項目，包括：

* 臨床來源多克隆抗體序列重建

• 疫苗免疫小鼠B細胞抗體譜圖解析

• zhuānlì抗體重建與結(jié)構(gòu)比對驗證

• 特殊修飾抗體（如糖基化）全序列圖譜重建

我們堅持以“算法+經(jīng)驗+驗證”三位一體的方法學(xué)策略，解決每一例高復(fù)雜度挑戰(zhàn)，為科研客戶提供真正可靠的技術(shù)支持。De Novo測序是一門技術(shù)壁壘高、數(shù)據(jù)處理復(fù)雜、解釋自由度大的技術(shù)。理解其原理與邊界，是每一位科研人員在項目啟動前應(yīng)掌握的基礎(chǔ)。我們希望本篇常見問題解析，能夠幫助您理性判斷、jīngzhǔn溝通、科學(xué)規(guī)劃實驗流程。如您有樣本準(zhǔn)備、實驗設(shè)計或技術(shù)細節(jié)問題，歡迎添加百泰派克技術(shù)顧問微信或訪問在線留言，我們將dìyī時間為您提供個性化解決方案。

百泰派克生物科技特色項目

一、蛋白測序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀及島津公司埃德曼降解測序系統(tǒng)對dànbáizhì序列進行分析，提供基于質(zhì)譜的蛋白測序分析服務(wù)，包括對dànbáizhì的氨基酸組成分析，Nduāncèxù，Cduāncèxù和全序列分析，以及基于埃德曼降解的dànbáizhìN端序列分析服務(wù)。對于未知理論序列的dànbáizhì，提供基于從頭測序法的dànbáizhì從頭測序服務(wù)，對蛋白序列進行分析。

※服務(wù)優(yōu)勢：

1.采用目前世界上優(yōu)良的質(zhì)譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實現(xiàn)對所測定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測定蛋白N端多達 70個氨基酸序列;

4.可測定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug，即可完成檢測;

6.測序不受N端封閉，PEC和和糖基化等N端修飾的影響。

二、dànbáizhì組學(xué)

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜平臺結(jié)合Nano-LC，提供定量dànbáizhì組學(xué)、靶向dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué)、翻譯后修飾蛋白組學(xué)等多種dànbáizhì組學(xué)分析服務(wù)。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4Ddànbáizhì組學(xué)服務(wù)，助力微量樣本蛋白組學(xué)、大樣本群醫(yī)學(xué)及高通量修飾組學(xué)等研究工作。

※服務(wù)優(yōu)勢：

1 .高通量定量蛋白分析:多對照組大規(guī)模實驗分析，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物;

2.體內(nèi)體外多種dànbáizhì標(biāo)記方法，適用于分析組織、細胞、血液等多種樣品;

3.質(zhì)譜分析靈敏度高，實驗結(jié)果重復(fù)度高;

4.可檢測較低豐度蛋白，線性范圍廣;

5.zhuānyè生物信息學(xué)分析，分析更系統(tǒng)準(zhǔn)確。

三、單細胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質(zhì)譜流式系統(tǒng)進行單細胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析，采用金屬元素標(biāo)記物（通常是金屬元素標(biāo)記的特異抗體）標(biāo)記細胞表面和內(nèi)部的分子，然后用流式細胞原理分離單個細胞，再用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）分析單個細胞的原子質(zhì)量譜，zuì后將原子質(zhì)量譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細胞表面和內(nèi)部的信號分子表達量。

※服務(wù)優(yōu)勢：

1.技術(shù)優(yōu)良，*技術(shù)空白

采用金屬標(biāo)記抗體技術(shù)，避免了傳統(tǒng)流式熒光通道少且易相互影響的問題。可在單細胞層面上對多種指標(biāo)同時進行表征，百泰派克生物科技可做到同時檢測51個目標(biāo)蛋白。

2.分析數(shù)量大，成本較低

單細胞RNAseq受成本等因素限制，所有樣本細胞匯總的分析數(shù)目一般在2x10^4個左右，而流式質(zhì)譜技術(shù)一次（單樣本）就可分析至少10^5的細胞，實現(xiàn)了數(shù)量級的提高，且成本不高于單細胞RNAseq。

3.應(yīng)用前景大

①流式質(zhì)譜結(jié)果可以給出細胞亞群的變化，在臨床診斷、疾病機制研究等方面具有極大的研究前景；

②將金屬標(biāo)簽技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合會有新應(yīng)用方向。除常規(guī)蛋白外，質(zhì)譜流式細胞技術(shù)還可用于蛋白翻譯后修飾；

③可檢測細胞存活率、細胞大小、mRNA轉(zhuǎn)錄子表達量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)

百泰派克生物科技的基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實現(xiàn)10,000個以上I型多肽和10,000個以上II型多肽的鑒定和識別。通過我們優(yōu)化的高通量免疫多肽組學(xué)分析平臺進行免疫肽組學(xué)分析，可從zuì小的樣品材料中進行可重復(fù)的識別和定量。該服務(wù)可以應(yīng)用于大規(guī)模的研究，旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案，深入挖掘未知的靶標(biāo)。

五、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，MALDI TOF，高效色譜分離技術(shù)，提供一系列完善的生物藥物分析方案，從dànbáizhì、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級結(jié)構(gòu)分析，到產(chǎn)品變異性和純度分析。旨在提供優(yōu)質(zhì)生物藥物分析服務(wù)，幫助生物醫(yī)藥生產(chǎn)商提高生物藥物品質(zhì)。

百泰派克生物科技七大檢測平臺

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物質(zhì)譜多組學(xué)優(yōu)質(zhì)服務(wù)商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫(yī)療器械行業(yè)提供質(zhì)量控制檢測和項目驗證等zhuānyè服務(wù)。公司實驗室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規(guī)和指導(dǎo)原則，通過CNAS/ISO9001雙重質(zhì)量體系認證，建立了完備的質(zhì)量體系，數(shù)據(jù)冷熱/異地備份，設(shè)備定期計量/期間核查，軟件審計追蹤，為客戶提供一體化解決方案和技術(shù)服務(wù)，支持新藥研發(fā)、藥物申報注冊和生產(chǎn)放行。

1.公司采用ISO9001質(zhì)量控制體系，zhuānyè提供以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的CRO檢測分析服務(wù)；

2.獲國家CNAS實驗室認可，為客戶提供符合全球藥政法規(guī)的藥物質(zhì)量研究服務(wù)；

3.業(yè)務(wù)范圍覆蓋dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué)、代謝組學(xué)、生物藥物表征、單細胞分析、單細胞質(zhì)譜流式、生信云分析以及多組學(xué)生物質(zhì)譜整合分析等；

4.七大質(zhì)量控制檢測平臺，滿足您一站式服務(wù)需求；

5.服務(wù)3000+企業(yè)，10000+客戶的選擇；

6.致力于為您提供優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)譜分析服務(wù)!

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