通過NIR-II熒光成像技術(shù)快速發(fā)現(xiàn)藥物引起的多器官功能障礙

本文要點(diǎn)：在藥物使用中，對多器官功能障礙進(jìn)行精確且快速的監(jiān)測至關(guān)重要。本文開發(fā)了一種多通道近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光生物成像方法，該方法能夠?qū)崟r、快速且定量地評估多器官功能障礙。同時，合成了一系列具有不同吸收和發(fā)射波長的NIR-II半花菁染料（HDs），通過修飾這些染料，實(shí)現(xiàn)了對肝臟、腎臟、胃和腸道的高空間和時間分辨率成像。該方法進(jìn)一步應(yīng)用于研究由順鉑（一種已知會導(dǎo)致胃排空問題以及肝腎損傷的藥物）引起的疾病。通過監(jiān)測這些器官中染料的代謝速率，準(zhǔn)確量化了多器官功能障礙，并得到了金標(biāo)準(zhǔn)病理分析的證實(shí)。此外，本文還評估了五種馬兜鈴酸（AAs）對多器官功能障礙的影響，發(fā)現(xiàn)AA-I和AA-II可引起胃排空障礙，這一發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。本文的研究引入了一種同時監(jiān)測多器官功能障礙的新方法，有望加快藥物副作用的評估。

活體成像

在本研究中，通過擴(kuò)展共軛體系、替換雜原子以及修飾各種取代模式，創(chuàng)建了一系列發(fā)射波長在674至1145納米之間的光譜可調(diào)諧的高分子量（HD）庫。研究者還運(yùn)用合理的分子工程，將HD3熒光團(tuán)片段與腎臟清除率增強(qiáng)功能片段（單-(6-(1,6-己二胺)-6-脫氧)-β-環(huán)糊精）融合，制得HD3-CD，該物質(zhì)同時具有肝臟和腎臟清除特性。因此研究者能夠進(jìn)行實(shí)時、無創(chuàng)的近紅外二區(qū)（NIR-II）成像，以評估順鉑誘導(dǎo)的肝臟和腎臟功能障礙（圖1A）。此外，分別研究了發(fā)射波長超過1100納米的耐酸HD6和HD14，以評估順鉑對胃和腸道的損傷（圖1B）?；诖?，進(jìn)一步建立了一個多通道生物成像平臺，利用HD6、HD3-CD和HD14在660、808和915納米激光下的優(yōu)異光譜區(qū)分能力，對肝臟、腎臟、胃和腸道進(jìn)行監(jiān)測（圖1C）。這種多色成像技術(shù)被用于鑒定由馬兜鈴酸I（AA-I）和馬兜鈴酸II（AA-II）引起的潛在胃排空障礙，并通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)（圖1D）。

圖1. 用于監(jiān)測藥物誘導(dǎo)的多器官功能障礙的多路近紅外二區(qū)（NIR-II）成像平臺設(shè)計

肝臟和腎臟功能障礙是藥物的常見副作用。監(jiān)測這些功能障礙對于防止腎毒性或肝毒性藥物上市至關(guān)重要。綜合考慮成像能力與結(jié)構(gòu)可修飾性后，選擇以HD3為基礎(chǔ)進(jìn)行改造，通過引入羧基獲得HD3-CAR，最終與腎清除增強(qiáng)組分（單-(6-(1,6-己二胺)-6-脫氧)-β-環(huán)糊精，HeβCD）耦聯(lián)制備HD3-CD。HD3-CD在水中最大吸收波長（λmaxabs）為704 nm，最大發(fā)射波長（λmaxem）為939 nm；在甲醇中λmaxabs為803 nm，λmaxem為940 nm。研究者評估了HD3-CD在肝腎功能障礙監(jiān)測中的應(yīng)用效果。以具有顯著腎毒性的化療藥物順鉑（20 mg/kg，72小時）為模型，通過NIR-II窗口動態(tài)觀測發(fā)現(xiàn)：順鉑處理組小鼠腎臟在HD3-CD注射后1小時和9小時的信號衰減速率（0.07±0.06和0.47±0.04）顯著慢于生理鹽水對照組（0.31±0.09和0.63±0.05）（圖3B）；肝臟信號在5小時和9小時的清除速率（0.11±0.2和0.24±0.05）也低于對照組（0.24±0.04和0.39±0.04）（圖3C），這與病理切片（圖S7A-B）及血液生化指標(biāo)（圖3D-E）結(jié)果一致，證實(shí)HD3-CD可通過NIR-II成像無創(chuàng)監(jiān)測順鉑引發(fā)的肝腎功能障礙。

順鉑還常引發(fā)胃腸道副作用，其強(qiáng)烈的胃腸毒性會降低患者的治療積極性。研究者嘗試建立比鋇餐和內(nèi)窺鏡等主流技術(shù)更安全便捷的近紅外二區(qū)（NIR-II）胃腸成像監(jiān)測模式。HD6、HD7和HD8在酸性條件下能保持穩(wěn)定的吸收強(qiáng)度。值得注意的是，HD6與HD3-CD的光譜間隔良好，為多重成像提供了基礎(chǔ)。

圖4. NIR-II多重成像

得益于HD6、HD3-CD和HD14的光譜間隔特性，基于近紅外二區(qū)（NIR-II）的多器官損傷多重監(jiān)測成像成為可能。這三種探針的吸收波段間隔近200 nm（圖4A），可分別通過660 nm、808 nm和915 nm激光正交激發(fā)且串?dāng)_極低——離心管中有機(jī)/水溶液的成像實(shí)驗(yàn)顯示：660 nm激發(fā)時，有機(jī)相與水相的熒光強(qiáng)度比分別為82.0/9.8/8.2和76.4/9.4/14.2（HD6主導(dǎo)）；808 nm激發(fā)時為1.5/80.5/18和2.2/66.8/31.0（HD3-CD主導(dǎo)）；915 nm激發(fā)時為9.2/11.9/78.9和1.7/23.6/74.7（HD14主導(dǎo)）（圖4B）。

基于此，對順鉑/PBS處理小鼠進(jìn)行雙通道成像：靜脈注射HD3-CD（808 nm激發(fā)，通道2）后口服HD6（660 nm激發(fā)，通道1），實(shí)現(xiàn)了胃腸、肝臟與腎臟的長期高對比度監(jiān)測（圖4C）。給藥0.3小時時，PBS組與順鉑組的腹側(cè)觀胃/肝臟信噪比（SNR）分辨率達(dá)2.7和10.7，背側(cè)觀胃/腎臟分辨率達(dá)3.0和21.8（支持信息圖S16A），其代謝特征與既往研究高度一致，證明該技術(shù)可創(chuàng)新性評估多器官損傷。

進(jìn)一步拓展的三通道成像技術(shù)中，尾靜脈注射HD3-CD、灌胃HD6后腹腔注射HD14，915 nm通道（通道3）專屬性顯示HD14標(biāo)記的腸道結(jié)構(gòu)（圖4D）。對照組與順鉑組的肝/腸SNR分辨率分別為11.1和14.0，胃/腸分辨率達(dá)4.6和4.2。相比雙通道成像，三通道技術(shù)能提供更全面的器官信息并規(guī)避病灶導(dǎo)致的成像缺失，但因腸道蠕動和HD14的漸進(jìn)吸收，其長期監(jiān)測能力稍遜。綜上，本文建立了可定制的多通道成像技術(shù)體系，為探索藥物多器官毒性及加速新藥研發(fā)提供了新工具。

圖5. AAs誘導(dǎo)多器官損傷的實(shí)時NIR-II成像和分析

馬兜鈴酸（AAs）是存在于馬兜鈴科植物中的毒性化合物，已知可誘發(fā)馬兜鈴酸腎病。通過雙通道成像技術(shù)，研究者期望為發(fā)現(xiàn)AAs更多潛在毒性提供有效證據(jù)。實(shí)驗(yàn)小鼠分別口服代表性AAs（20 mg/kg，包括AA-I、AA-II、AA-IIIa、AA-IVa和AL-I）及PBS對照組，治療6天后尾靜脈注射HD3-CD并灌胃HD6（圖5A-B），利用近紅外成像監(jiān)測腎臟、肝臟和胃部信號（圖5C）。結(jié)果顯示：HD3-CD注射1小時后，各處理組小鼠腎臟信號衰減值分別為AA-I（0.03±0.04）、AA-II（0.07±0.04）、AA-IIIa（0.35±0.07）、AA-IVa（0.26±0.09）、AL-I（0.30±0.10）和PBS組（0.31±0.08），其中AA-I和AA-II組的腎清除效率顯著低于其他組（圖5D）；注射5小時后，AA-I和AA-II組的肝臟信號衰減值（0.12±0.07和0.18±0.07）顯著低于對照組（0.28±0.05）及其他處理組（圖5E）；胃部熒光信號在AA-I和AA-II組持續(xù)偏高，3小時時強(qiáng)度分別達(dá)對照組的9.3倍和9.7倍（圖5F）。圖5G綜合對比顯示，AA-I和AA-II組的探針清除效率在肝（5小時）、腎（1小時）、胃（3小時）三個器官均低于AA-IIIa、AL-I和PBS組，表明AA-I和AA-II對肝臟、腎臟及胃功能均有顯著損害。血液生化指標(biāo)（圖5H）與病理切片進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果與探針清除效率變化趨勢一致。本研究通過雙色成像技術(shù)揭示了AA-I和AA-II可能引發(fā)的胃排空障礙。

圖6. AA-I/II誘導(dǎo)的肝、腎和胃損傷的蛋白質(zhì)印跡和轉(zhuǎn)錄組分析

之后，本文通過Western blot分析了AA-I和AA-II處理組小鼠肝腎組織中炎癥相關(guān)蛋白（NF-κB、NLPR3）、纖維化相關(guān)蛋白（TGF-β、SMAD3）及凋亡標(biāo)志物（BAX）的表達(dá)水平。腎臟中，與對照組相比，AA-I組的BAX、TGF-β、NLPR3和NF-κB表達(dá)均升高，AA-II組的BAX和NF-κB顯著上調(diào)（圖6A）；肝臟中，兩種處理組的BAX、TGF-β、SMAD3、NLPR3和NF-κB表達(dá)均明顯增加（圖6B）。進(jìn)一步對AA-I和AA-II處理組的胃組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，主成分分析顯示組間樣本分散而組內(nèi)聚類良好（圖6C）。差異基因分析發(fā)現(xiàn)，AA-I組共有1936個差異基因（上調(diào)1268個，下調(diào)668個）（圖6D），AA-II組達(dá)5973個（上調(diào)2757個，下調(diào)3216個）（圖6E）。KEGG富集分析表明，AA-I主要影響細(xì)胞因子-受體相互作用、病毒蛋白-細(xì)胞因子互作、補(bǔ)體凝血級聯(lián)、IL-17信號通路、蛋白質(zhì)消化吸收及趨化因子信號通路（圖6F）；而AA-II則顯著干擾核糖體、蛋白質(zhì)消化吸收、細(xì)胞黏附分子、胃酸分泌及血管平滑肌收縮等通路（圖6G），提示兩種毒素通過不同分子機(jī)制干擾胃功能動態(tài)平衡。

參考文獻(xiàn)

Jiang Pu et al., Rapid discovery of drug-introduced multiple organ dysfunction via NIR-II fluorescent imaging, Acta Phar-maceutica Sinica B

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動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

In Vivo Imaging System

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