結(jié)直腸癌治療利用镥基納米探針提高放射增敏并實(shí)現(xiàn)NIR-II熒光成像引導(dǎo)手術(shù)

本文要點(diǎn)：結(jié)直腸癌（CRC）是全球發(fā)病率最高的五大癌癥之一。針對局部晚期CRC，臨床推薦采用術(shù)前同步放化療方案。作為傳統(tǒng)癌癥治療手段，放療（RT）不僅能控制局部腫瘤生長，還能誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡并引發(fā)系統(tǒng)性免疫應(yīng)答。鑒于CRC對放療敏感性較差，提升放射增敏效果成為亟待解決的關(guān)鍵問題。雖然術(shù)中影像技術(shù)取得進(jìn)展，但實(shí)現(xiàn)結(jié)直腸腫瘤實(shí)時(shí)精準(zhǔn)切除并確保切緣陰性仍是重大臨床挑戰(zhàn)。本研究開發(fā)的新型多功能熒光納米探針RVLu@ICG具有近紅外二區(qū)（NIR-II）發(fā)光特性：通過環(huán)狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸五肽（c(RGDfK)）修飾實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向富集，并在電離輻射下顯著增強(qiáng)活性氧（ROS）生成。這種協(xié)同機(jī)制既能增強(qiáng)放射增敏效果，又可促進(jìn)放療誘導(dǎo)的腫瘤免疫微環(huán)境重塑。NIR-II熒光成像導(dǎo)航系統(tǒng)成功在微小腫瘤模型、肌層浸潤模型和腹膜轉(zhuǎn)移模型中實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)手術(shù)引導(dǎo)。該納米探針在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性，為CRC治療建立了可靠的精準(zhǔn)診療一體化平臺(tái)。

活體成像

圖1. 合成和應(yīng)用的示意圖：RVLu@ICG用于NIR-II熒光引導(dǎo)靶向放射增敏、免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)和精確CRC手術(shù)切除的納米探針

圖2. 納米探針的合成與表征

采用傳統(tǒng)雙相合成法和硬模板法制備了病毒模擬介孔二氧化硅納米顆粒（VSi）。在弱堿性環(huán)境中溫和攪拌72小時(shí)后，透射電子顯微鏡（TEM）觀察到成功制備出粒徑約100納米、具有典型病毒樣表面結(jié)構(gòu)的均勻顆粒（圖2A）。以VSi為核模板，六水合硝酸镥（Lu(NO3)3·6H2O）為镥源，烏洛托品為還原劑，經(jīng)80/90℃反應(yīng)17小時(shí)后，成功獲得直徑約110納米的均一中空病毒樣介孔氧化镥納米球（VLu），其表面呈現(xiàn)粗糙形貌（圖2A）。掃描電子顯微鏡（SEM）進(jìn)一步證實(shí)VSi與VLu均具有均勻的仿生病毒樣納米結(jié)構(gòu)（圖2B）。高角度環(huán)形暗場掃描電鏡（HAADF）結(jié)合元素分布圖顯示，Lu和氧（O）在單個(gè)VLu納米結(jié)構(gòu)中呈均勻空間分布，驗(yàn)證了镥整合中空納米探針的成功構(gòu)建（圖2C）。通過氨基硅烷（APTES）對VLu進(jìn)行氨基功能化后，使用NHS/EDC將c(RGDfK)肽段共價(jià)偶聯(lián)至VLu表面（RVLu）。高分辨透射電鏡（HRTEM）分析表明RVLu由相互貫穿的納米顆粒組成（圖2D），無晶格條紋的特征證實(shí)其非晶態(tài)性質(zhì)。紫外-可見吸收光譜在258nm處出現(xiàn)c(RGDfK)肽段特征吸收峰（圖2E），結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線定量顯示c(RGDfK)負(fù)載率為17.01%（質(zhì)量比1:11.76）。Zeta電位測試顯示各制備階段表面電荷變化（圖2F），動(dòng)態(tài)光散射（DLS）檢測顯示VLu、VLu-NH2和RVLu的流體力學(xué)直徑分別為112.45nm、120.54nm和136.87nm（圖S6），共同佐證了肽段偶聯(lián)策略的有效性。

隨后將ICG封裝于中空RVLu顆粒中（RVLu@ICG），根據(jù)ICG標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其負(fù)載效率達(dá)23.56%（圖2G）。吸收光譜顯示RVLu@ICG與游離ICG均在780nm附近存在特征峰，證實(shí)ICG成功嵌入納米探針空腔（圖2H）。在808nm激光激發(fā)并通過1000nm長通濾光片檢測時(shí)，兩者均表現(xiàn)出超過1000nm的NIR-II特征發(fā)射譜（圖2I），驗(yàn)證了其在NIR-II窗口的光學(xué)活性。通過紫外分光光度計(jì)和電感耦合等離子體測定，RVLu@ICG中ICG、Lu與c(RGDfK)的摩爾比為1:330.65:18.54。

圖3. 體外RVLu@ICG細(xì)胞毒性、細(xì)胞攝取和RT敏感性測試

癌細(xì)胞精準(zhǔn)識(shí)別是實(shí)現(xiàn)腫瘤組織精準(zhǔn)治療的關(guān)鍵。采用流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）評(píng)估RVLu@ICG的腫瘤靶向性能。在檢測細(xì)胞攝取前，通過溶血實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證納米探針的生物相容性。溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖3A），RVLu@ICG在所有濃度（0-80μM）下的溶血率均低于5%，表明其具有良好的血液相容性。實(shí)驗(yàn)評(píng)估發(fā)現(xiàn)，經(jīng)c(RGDfK)修飾的RVLu@ICG在流式檢測中細(xì)胞攝取量約為未修飾VLu@ICG的兩倍（圖3B），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。CLSM觀察顯示，與CT26細(xì)胞共孵育4小時(shí)后，RVLu@ICG組的紅色熒光（ICG）強(qiáng)度是VLu@ICG組的三倍（圖3C；P<0.01）。通過競爭抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，預(yù)先用過量c(RGDfK)肽處理的細(xì)胞對RVLu@ICG攝取顯著降低（流式結(jié)果圖S17-18，P<0.001；CLSM結(jié)果圖3C，P<0.0001），證實(shí)c(RGDfK)功能化能賦予镥基納米探針精準(zhǔn)識(shí)別腫瘤細(xì)胞的能力。

隨后研究者進(jìn)一步評(píng)估了RVLu@ICG在放射治療（RT）中的增敏效應(yīng)。X射線照射（4 Gy）條件下，納米顆粒（Lu3?濃度=20 μM）的細(xì)胞毒性顯著高于單純放療組（P < 0.001），表明納米顆粒介導(dǎo)的RT能顯著增強(qiáng)輻射誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡（圖3D）。通過克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相較于單純RT組，RVLu@ICG聯(lián)合處理組形成的存活細(xì)胞克隆數(shù)顯著減少（P < 0.001）（圖3E）。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示RVLu@ICG+RT組的細(xì)胞凋亡率顯著高于單純RT組（P < 0.001）（圖3F）。值得注意的是，镥基納米顆粒（RVLu@ICG）的放射增敏效果明顯優(yōu)于釓基（RVGd@ICG）和釹基（RVNd@ICG）材料（P < 0.001）?；陔婋x輻射通過活性氧（ROS）介導(dǎo)DNA損傷的機(jī)制，DCFH-DA染色顯示：照射后RVLu@ICG組的綠色熒光強(qiáng)度與MFI值均顯著高于PBS對照組（P < 0.0001）（圖3H,I），而未照射組的熒光信號(hào)均較弱。流式檢測證實(shí)RVLu@ICG+RT處理的CT26細(xì)胞ROS水平是單純RT組的8倍（圖3G），表明該納米探針能通過顯著提升X射線誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)量，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡/壞死。這些結(jié)果共同驗(yàn)證了RVLu@ICG具有強(qiáng)大的放射增敏作用，能有效抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其死亡，是一種前景放射治療納米劑。

圖4. RVLu@ICG在體內(nèi)安全性和腫瘤靶向效率評(píng)估

在開展活體熒光成像研究前，本文首先評(píng)估了RVLu@ICG的體內(nèi)安全性。將健康雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為四組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示RVLu@ICG組與PBS對照組相似，在四周觀察期內(nèi)均未出現(xiàn)體重異常波動(dòng)（圖4A）。通過系列采集靜脈血樣（第0/1/7/28天）進(jìn)行肝腎功能檢測及血常規(guī)分析，發(fā)現(xiàn)肌酐（CREA）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和尿素氮（BUN）水平保持穩(wěn)定（圖4B），血小板（PLT）、紅細(xì)胞（RBC）、淋巴細(xì)胞（Lymph）及白細(xì)胞（WBC）計(jì)數(shù)亦無顯著變化（圖4C）。蘇木精-伊紅（HE）染色器官切片顯示兩組均未出現(xiàn)明顯病理損傷（圖4D），證實(shí)RVLu@ICG具有良好生物安全性?；隗w外腫瘤靶向性和體內(nèi)低毒性的驗(yàn)證結(jié)果，研究者在BALB/c小鼠皮下接種CT26-Luc腫瘤細(xì)胞建立模型。通過尾靜脈注射ICG、VLu@ICG或RVLu@ICG后，采用808 nm激發(fā)光（100 mW/cm2）和1000 nm長通濾光片進(jìn)行NIR-II熒光成像。結(jié)果顯示ICG組腫瘤區(qū)域熒光信號(hào)微弱，而RVLu@ICG組在注射48小時(shí)后呈現(xiàn)強(qiáng)烈的腫瘤特異性熒光（圖4E,F），其最大腫瘤背景比（TBR=6.50±1.10）顯著高于VLu@ICG組（4.49±0.63）和ICG組（2.49±1.08）（圖4G，P<0.05）。熒光信號(hào)在96小時(shí)后消退，但RVLu@ICG組在所有時(shí)間點(diǎn)均保持更高腫瘤熒光強(qiáng)度（圖4F）。根據(jù)Rose標(biāo)準(zhǔn)（TBR>5可滿足精準(zhǔn)成像），RVLu@ICG展現(xiàn)出更優(yōu)的腫瘤鑒別能力。通過預(yù)注射c(RGDfK)的阻斷實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證靶向特異性，48小時(shí)后RVLu@ICG組的熒光強(qiáng)度（7.65±1.61）顯著高于阻斷對照組（2.40±0.44）（圖4H；圖S26，P<0.01）。離體器官熒光成像顯示，注射48小時(shí)后納米探針在腫瘤及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)器官（肝、腎、肺）中均有較高蓄積（圖4I,J）。這些結(jié)果共同證實(shí)RVLu@ICG具有精準(zhǔn)的結(jié)直腸癌靶向能力。

基于Lu3?的X射線激活康普頓散射特性，通過靜脈給藥評(píng)估了RVLu@ICG對荷瘤小鼠的腫瘤生長抑制作用。將攜帶CT26腫瘤的小鼠隨機(jī)分為四組：PBS對照組、RVLu@ICG組、單純放療（RT）組及RVLu@ICG+RT聯(lián)合組。如圖5A、D、E所示，未照射的PBS組和RVLu@ICG組腫瘤持續(xù)生長；而X射線照射后，RVLu@ICG+RT組表現(xiàn)出顯著增敏效果，腫瘤體積較單純RT組明顯縮?。▓D5A、F、G）。第18天解剖顯示，聯(lián)合治療組腫瘤重量最輕（圖5B、C），證實(shí)其具有腫瘤清除與生長抑制能力。照射后6天小鼠體重短暫下降，第10天恢復(fù)至正常水平（圖5H）。為深入評(píng)估療效，治療18天后對腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)分析。Ki67增殖標(biāo)志物染色顯示，聯(lián)合組的陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于其他組（圖5I、J）；同時(shí)該組caspase-3活性明顯升高（圖5I、K），表明RVLu@ICG通過激活caspase-3及其下游通路協(xié)同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果和HE染色結(jié)果共同驗(yàn)證了RVLu@ICG能有效增強(qiáng)放療誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡并抑制進(jìn)展。

圖6. 微腫瘤模型、肌內(nèi)腫瘤浸潤模型和腹部轉(zhuǎn)移癌模型中RVLu@ICG的手術(shù)導(dǎo)航

注射后48小時(shí)觀察到最高腫瘤背景比（TBR），確定為近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光引導(dǎo)腫瘤切除的最佳時(shí)機(jī)。為評(píng)估納米探針對微小腫瘤的術(shù)中檢測能力，本文建立了多發(fā)性微小腫瘤模型。術(shù)中熒光信號(hào)與生物發(fā)光成像結(jié)果高度吻合（圖8A），證實(shí)NIR-II熒光成像能精確界定腫瘤邊界。對應(yīng)HE染色顯示，在NIR-II引導(dǎo)下切除的7個(gè)微腫瘤直徑約0.5-3毫米，腫瘤與正常組織分界清晰（圖8B）。值得注意的是，直徑不足1毫米的T3、T4和T5微腫瘤均被準(zhǔn)確識(shí)別，凸顯RVLu@ICG對術(shù)中殘留微小病灶的檢測優(yōu)勢。

通過構(gòu)建肌肉內(nèi)腫瘤浸潤模型，研究者驗(yàn)證了RVLu@ICG探針在熒光成像系統(tǒng)中精確定位腫瘤的可行性。將CT26-Luc細(xì)胞植入BALB/c小鼠肌肉組織形成300-400 mm3腫瘤后，在無菌條件下麻醉荷瘤小鼠。如圖8C所示，注射RVLu@ICG 48小時(shí)后，腫瘤邊緣通過NIR-II成像系統(tǒng)清晰顯現(xiàn)（圖8C I,IV）。白光下切除原發(fā)灶（P1）后，NIR-II成像發(fā)現(xiàn)術(shù)床殘留熒光信號(hào)（圖8C II,V），遂追加切除（P2）。808 nm激光復(fù)檢確認(rèn)熒光信號(hào)消失（圖8C III,VI）。離體成像顯示P1/P2具有強(qiáng)熒光而肌肉組織無信號(hào)（圖8E），HE染色證實(shí)熒光區(qū)域均為腫瘤組織（圖8F），表明該探針可有效區(qū)分腫瘤與正常組織。相比之下，ICG組多數(shù)殘留腫瘤無熒光信號(hào)（圖8D），凸顯傳統(tǒng)染料的局限性。

術(shù)后14天生物發(fā)光成像顯示，RVLu@ICG引導(dǎo)手術(shù)組無局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而ICG組80%小鼠及對照組全部出現(xiàn)原位復(fù)發(fā)。生存分析顯示RVLu@ICG組小鼠生存期顯著優(yōu)于ICG組與白光手術(shù)組（圖8G）。進(jìn)一步在結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移模型中評(píng)估了RVLu@ICG近紅外二區(qū)納米探針的術(shù)中成像潛力。生物發(fā)光成像首先確認(rèn)了腫瘤存在并提供了大致定位。在無菌條件下對異氟烷麻醉的小鼠實(shí)施手術(shù)，通過NIR-II熒光成像依次引導(dǎo)腫瘤切除（圖8H）。NIR-II成像清晰顯示了1-8號(hào)腫瘤邊界（圖8H），切除組織的HE染色驗(yàn)證了腫瘤邊緣的精準(zhǔn)界定（圖8I）。術(shù)后14天的生物發(fā)光監(jiān)測顯示，所有手術(shù)區(qū)域均未出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移跡象。

本文成功開發(fā)出具有優(yōu)異生物相容性和高光穩(wěn)定性的創(chuàng)新型近紅外二區(qū)（NIR-II）可降解熒光納米探針RVLu@ICG，該探針集放療增敏、免疫微環(huán)境重塑和手術(shù)精準(zhǔn)導(dǎo)航三大功能于一體?；诟咴有驍?shù)元素镥（Lu）顯著的X射線吸收效率，RVLu@ICG不僅能增強(qiáng)結(jié)直腸癌腫瘤的放射敏感性，還能通過放射增敏效應(yīng)重塑腫瘤免疫微環(huán)境，從而激活免疫系統(tǒng)放大免疫殺傷效應(yīng)。在多種荷瘤模型實(shí)驗(yàn)中，該探針可精準(zhǔn)引導(dǎo)NIR-II熒光成像實(shí)現(xiàn)腫瘤切除，顯著提高實(shí)驗(yàn)對象總體生存率。更值得關(guān)注的是，該納米探針無毒性且不會(huì)造成器官損傷或急性危害，展現(xiàn)出良好的臨床轉(zhuǎn)化前景。這種多功能探針為結(jié)直腸癌制定了完整的精準(zhǔn)治療方案：術(shù)前通過新輔助放療聯(lián)合免疫微環(huán)境重塑實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞清除和瘤體減容；術(shù)中借助NIR-II熒光導(dǎo)航精準(zhǔn)切除殘余微病灶。這種整合治療策略對改善患者生存預(yù)后具有重大意義，有望成為臨床腫瘤治療的優(yōu)選方案。

參考文獻(xiàn)

Dang Y, Liu X, Zheng Z, et al. Lutetium‐Based Nanoprobes for Radiosensitization with Immune Microenvironment Remodeling and NIR‐II Fluorescence Imaging‐Guided Surgery in Colorectal Cancer[J]. Advanced Science, 2025: e10136.

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上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，被評(píng)為“國家高新技術(shù)企業(yè)"、“上海市專精特新中小企業(yè)"，獲批主持“科技部重大儀器專項(xiàng)"子課題，榮獲上海市“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃"科學(xué)儀器項(xiàng)目、上海市2025年度關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)計(jì)劃“計(jì)算生物學(xué)"項(xiàng)目。

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