支原體QPCR檢測，三復(fù)孔重復(fù)性不好的原因？

復(fù)孔重復(fù)性不好，可能有以下幾種原因：

首先，判斷各個參數(shù)設(shè)置是否正確，例如是否扣除ROX（ABI系列機(jī)器）、基線和閾值線等；

其次，判斷內(nèi)參通道是否異常，判斷PCR反應(yīng)是否正常進(jìn)行；

第三，CT值是否落在35之后，這是熒光定量PCR反應(yīng)的灰區(qū)，在這個區(qū)間的CT值重復(fù)性非常差；

第四，試劑盒本身問題，酶、引物探針、反應(yīng)條件等優(yōu)化不完善；

第五，加樣誤差；

第六，儀器長時間未校準(zhǔn)。

針對這幾種原因，進(jìn)行逐一排查

第一種情況，排查各類參數(shù)設(shè)置，看看是否能夠解決問題；

第二種情況，如確實(shí)內(nèi)參通道CT值異常，明顯偏離說明書設(shè)定的范圍，則樣本中存在PCR抑制成分，需稀釋10倍或抽提核酸進(jìn)行檢測；

第三種情況，需依據(jù)擴(kuò)增曲線是否具備典型的S型來判斷，如兩次檢測均具備典型的S型擴(kuò)增曲線，則判為支原體陽性，樣本發(fā)生了極其微弱的支原體污染；反之，則應(yīng)為支原體陰性。

第四種情況，需要重新優(yōu)化試劑盒。

第五種情況，建議移液器定期校準(zhǔn)，使用時規(guī)范操作。

第六種情況，儀器要定期校準(zhǔn)。