IgG 在血清里占 7–10 mg/mL，濃度比細(xì)胞因子高一萬(wàn)倍，信號(hào)卻容易“頂天"。把 Mouse IgG ELISA Kit 拆成 5 段反應(yīng)鏈，每段給出抗體親和常數(shù)、檢測(cè)上限與誤差來(lái)源，看完就知道高背景從哪來(lái)、該怎么鎖范圍。
廠商用 pH 9.6 碳酸鹽緩沖液把捕獲抗體固定在微孔板，4 ℃ 過(guò)夜。
關(guān)鍵數(shù)字：
每孔包被量 0.75 µg，對(duì)應(yīng) 5×10^12 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，遠(yuǎn)超 100 ng 樣本 IgG，確保鉤狀效應(yīng)出現(xiàn)在 50 µg/mL 而非 5 µg/mL。
親和常數(shù) 2×10^9 M?1 保證解離率 k_off 0.0005 s?1，洗板 5 次損失 <1 %。
BSA 便宜但含 IgG 污染，酪蛋白純度 ≥95 %，封閉后非特異結(jié)合可降到 0.02 OD。
操作節(jié)點(diǎn)：200 µL/well，室溫 120 min，濕度 60 % 以上防止邊緣蒸發(fā)。封閉液里加 0.05 % Tween-20，能把疏水吸附再降 30 %。
100 µL 樣本加入后，IgG 濃度 1 µg/mL 時(shí)，理論碰撞次數(shù) 3×10^4 s?1，結(jié)合反應(yīng) 30 min 達(dá)到 90 % 平衡。
誤差來(lái)源：
紅細(xì)胞裂解釋放血紅蛋白，在 405 nm 吸收峰與 HRP-TMB 重疊，造成正偏差 5 %–8 %。
血脂 >3 % 時(shí)形成乳糜微粒，IgG 被包裹，有效濃度下降 12 %，結(jié)果偏低。
F(ab’)? 去掉 Fc 后不與類風(fēng)濕因子結(jié)合，RF-IgG 復(fù)合物假陽(yáng)性從 0.08 OD 降到 0.01 OD。
工作濃度：0.25 µg/mL，對(duì)應(yīng)摩爾濃度 1.7 nM，與樣本 IgG 形成 1:1 夾心，檢測(cè)上限鎖在 50 µg/mL，超過(guò)即進(jìn)入 Hook 平臺(tái)。
HRP 催化 TMB 的米氏常數(shù) K_m 0.18 mM，試劑盒 TMB 濃度 0.4 mM 屬于飽和底物。
線性區(qū)間：
0–3 ng HRP 對(duì)應(yīng) 0–2.0 AU，R2 0.999。
12 min 顯色后 1 AU≈1.25 µg/mL IgG，換算系數(shù)印在 COA 第三頁(yè)，批次間差異 <4 %。
板底自身吸光 0.015 AU
TMB 微量自發(fā)氧化 0.010 AU
親和素殘留 0.006 AU
封閉劑吸光 0.004 AU
總空白 0.035 AU 是行業(yè)均值，超過(guò) 0.05 AU 說(shuō)明封閉失敗或洗板不清潔，整批數(shù)據(jù)應(yīng)棄用。
一步法把樣本與 HRP 抗體同時(shí)加入，孵育 45 min 完成，適合高通量篩選，檢測(cè)限 30 ng/mL。
兩步法先樣本 60 min 再檢測(cè) 60 min，背景更低，檢測(cè)限 3 ng/mL，適合血清 IgG 亞類測(cè)定。
| 階段 | 主要誤差 | 誤差范圍 | 可控手段 |
|---|---|---|---|
| 包被 | 抗體吸附不均 | 2 % | 4 ℃ 平置 |
| 封閉 | 蒸發(fā)濃縮 | 3 % | 濕盒 |
| 樣本 | 溶血 | 8 % | 30 min 內(nèi)離心 |
| 檢測(cè) | Hook 效應(yīng) | 50 % | 預(yù)稀釋 1:1000 |
| 顯色 | 讀數(shù)延時(shí) | 5 % | 30 min 內(nèi)讀板 |
把每段誤差鎖在表格范圍內(nèi)，總不確定度可壓到 6 % 以內(nèi)，符合 ELISA 定量標(biāo)準(zhǔn) ISO/TS 21003。
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
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