IGFBP-6：把“測不到”變成“測得準(zhǔn)”的操作手記

先認(rèn)亞型，再開實驗

人源 IGFBP-6 全長 240 aa，分泌后 N 端 24 aa 信號肽被切，循環(huán)以 22 kDa 形態(tài)存在。小鼠多一段 3 aa 插入，抗體跨種屬識別掉 50 % 信號。下單蛋白前，把物種、剪接版本寫進采購備注，避免 Western 白板。

樣本類型：血清 vs 腦脊液，稀釋曲線不在一條線

血清 IGFBP-6 濃度 150–250 ng/mL，含大量 IGF-II 復(fù)合物，ELISA 需酸解離 30 min，否則信號被遮蔽 70 %。腦脊液濃度只有 5–15 ng/mL，酸解離步驟可省，直接上樣 100 µL，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液用人工腦脊液，回收率 98 %。

前處理：酸解離+中和，pH 漂移 0.1 就翻車

酸解離液 0.3 M Gly-HCl pH 2.5，中和液 1 M Tris pH 9.5。操作順序：

1. 樣本 50 µL + 酸解離液 50 µL，混勻 30 min

2. 一次性加入中和液 25 µL，立即渦旋

3. 10 min 內(nèi)上板，pH 回彈到 7.2 ± 0.1

延遲 20 min 再上樣，復(fù)合物重新形成，標(biāo)準(zhǔn)曲線高值點掉 30 %。

抗體對：表位重疊 3 aa 就能讓信號腰斬

做血清檢測，直接選 84802 包被 + 67710 檢測，配對信號落差 <5 %。

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：一步 vs 兩步，CV 差 1.5 倍

一步稀釋：標(biāo)準(zhǔn)品直接溶于樣本稀釋液，高值點 200 ng/mL，CV 8 %

兩步稀釋：先配 2 µg/mL 儲液，-80 °C 分裝，實驗前再稀釋，CV 3 %

建議：月用量 >10 塊板，用兩步法，標(biāo)準(zhǔn)曲線有效期 14 天，節(jié)省 15 % 試劑。

洗板機維護：針頭殘留 2 µL 就能讓空白升高 0.05

洗板程序結(jié)束，用 0.1 % Tween-20 沖洗 3 次，再純水沖洗 2 次。每周拆下針頭，浸泡 1 % 次氯酸鈉 10 min，空白 OD 從 0.08 降到 0.02。針頭壽命 2000 塊板，逾期不換，高值點 OD 掉 30 %。

曲線擬合：四參數(shù) log-log 不如五參數(shù)

IGFBP-6 高值區(qū)平臺斜率小，四參數(shù)擬合 R2 0.98，回收率 80 %。五參數(shù)擬合引入不對稱因子，R2 0.996，回收率 95 %。軟件缺省用四參數(shù)，手動切換到五參數(shù)，高值樣本無需再稀釋，省 20 % 重復(fù)孔。

質(zhì)控圖：Levey-Jennings 圖 + 西格瑪規(guī)則

每天插 2 個濃度質(zhì)控，20 天建立靶值。用 1-3s 規(guī)則，失控點立即重測。記錄發(fā)現(xiàn)：失控 80 % 發(fā)生在周三，原因是周二人少，洗板機針頭未沖干凈。把周三程序改成雙倍沖洗，失控率降到 2 %。

數(shù)據(jù)云備份：掃碼槍 10 秒完成

ELISA 讀板后，用掃碼槍掃板條碼，數(shù)據(jù)自動上傳 Gitter 云，生成不可更改的 PDF 報告。審計追蹤時間戳精確到秒，F(xiàn)DA 21 CFR Part 11 審查一次通過，省去紙質(zhì)簽字 30 min。