MMP-2 活性檢測實驗：操作使用全流程

1. 名稱迷宮：一次說清 CLG4、MONA、TBE-1 到底指誰

基因符號 MMP2 編碼蛋白 Matrix Metalloproteinase-2，實驗室口語簡稱 Gelatinase A。CLG4 與 CLG4A 是早期克隆編號，MONA、TBE-1 來自不同課題組測序時隨意命名的 cDNA，文獻里偶爾回潮。抗體說明書若寫 Anti-TBE-1，先核對 UniProt 登錄號 P08253，避免把 MMP-9 抗體錯當成 MMP-2。

2. 樣本類型選擇：血清、細胞上清還是組織勻漿

血清含內(nèi)源性 MMP-2 主要以無活性的 pro-form 存在，測活性需先加入 APMA 進行體外激活。細胞上清里 MMP-2 活性與侵襲表型直接相關，適合藥效評價。組織勻漿要注意：液氮研磨后立刻用 1% Triton X-114 相分離，去除膜結合型 MMP-2，否則后續(xù)條帶拖尾。

3. 明膠酶譜法：仍是活性金標準

配制 8% SDS-PAGE 時加入 1 mg/mL 明膠，電泳完成后 2.5% Triton X-100 洗 2×30 min，把 SDS 去掉。孵育緩沖液 pH 7.5，加 5 mM CaCl? 與 1 μM ZnCl?，37 ℃ 靜置 20 h?？捡R斯亮藍 R-250 染色 1 h，脫色到深藍背景出現(xiàn) 72 kDa 白透明條帶。條帶灰度與活性成正比，線性范圍 5–120 ng，靈敏度足以檢測 1×10? 個黑色素瘤細胞的分泌量。

4. 熒光底物動力學：高通量藥物篩選

MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH? 底物在 37 ℃ 被活性 MMP-2 切斷，釋放熒光 393/472 nm。96 孔板體系 100 μL，酶終濃度 50 ng/mL，底物 10 μM。反應啟動后連續(xù)讀板 10 min，斜率即酶活。抑制劑 IC?? 曲線用 10 點三倍稀釋，Z? 因子 0.78 視為合格。注意 DMSO 終濃度 ≤1%，否則出現(xiàn)假陽性。

5. 避免假陰性：金屬離子平衡

EDTA 痕量殘留就能把活性降到零。玻璃器皿用 10 mM HCl 浸泡一夜，再用去離子水沖三遍。緩沖液現(xiàn)加 Ca2?、Zn2?，放置超過 6 h 重新配制。實驗室老式金屬水浴鍋常含 Fe3?，用塑料槽代替，防止離子串擾。

6. 定量校準：活性單位與蛋白質(zhì)量脫鉤

商業(yè)重組人 MMP-2 活性批次差異大，別用 ng 當橫坐標。用已知比活 1200 U/mg 的參考品做梯度，繪制 U/mL-熒光斜率標準曲線。每次實驗帶兩點校準，偏差 >8% 即重跑。發(fā)文章時把“活性單位"寫進方法，審稿人不再追問。

7. 抑制劑驗證：GM6001 濃度窗口

GM6001 對 MMP-2 Ki ≈ 0.4 nM，實際工作濃度 2.5 μM 可全抑制。預實驗做 0–10 μM 梯度，確認 72 kDa 白帶消失即可。別一口氣加到 25 μM，容易脫靶抑制 MMP-9，導致數(shù)據(jù)解釋混亂。

8. 時間梯度：別錯過前體激活峰

APMA 激活 pro-MMP-2 呈時間依賴，1 mM APMA 37 ℃ 處理 0–120 min，每 15 min 取樣。Western 用抗催化域抗體，可見 72 kDa 條帶逐漸下移 2 kDa，代表前肽切除?；钚詸z測同步進行，20–30 min 達峰值，過度激活反而自降解，信號下降。

9. 雙酶共顯：MMP-2 與 MMP-9 同板區(qū)分

酶譜膠里 92 kDa 位置常出現(xiàn) MMP-9 條帶。用 MMP-9 中和抗體 2 μg/mL 預先孵育樣本 1 h，92 kDa 白帶消失，72 kDa 不受影響，即可確認身份。熒光法直接選 MCA-PLGL-Dpa-AR，該序列 MMP-2 kcat/Km 比 MMP-9 高 6 倍，交叉干擾 <5%。

10. 數(shù)據(jù)報告：把灰度換成活性單位

酶譜膠拍照后用 ImageJ 量灰度，先轉(zhuǎn)換成“相對活性"，再乘以當日校準曲線斜率，得到 U/mL。審稿人常問“為何不用 Western 定量"，回答“Western 測的是蛋白量，非活性"即可過關。附原始膠圖時標注白框，防止被質(zhì)疑裁剪。