解析逆轉(zhuǎn)錄實驗中操作問題2022/08/01

逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）實驗作為是常見的分子生物學(xué)實驗之一，逆轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板合成DNA的過程，即RNA指導(dǎo)下的DNA合成，逆轉(zhuǎn)錄實驗包括3大要素，分別是引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA模板。雖然看上去步驟簡單，但是逆轉(zhuǎn)錄實驗中實際操作時常出現(xiàn)問題如下：1.如何提高RT-PCR反應(yīng)的靈敏度與特異性？①確定模板RNA完整性好，無DNA污染。②RNA模板中不應(yīng)含有擴增反應(yīng)抑制劑。③使用適量的模板RNA，模板量太多會降低特異性，太少會導(dǎo)致擴增不出條帶或條帶太弱。④若模板中有二級結(jié)構(gòu)

IHC常用酶標二抗原理及特點2022/07/25

免疫組化（IHC）是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理和特殊的標記技術(shù)，通過化學(xué)反應(yīng)使標記抗體顯色，對組織細胞內(nèi)的特異性抗原進行定位、定性、定量檢測的一門技術(shù)。本文主要總結(jié)二抗原理及其特點，以提供更好的選擇。IHC常用酶標二抗原理圖1.SABC法原理：SABC法是利用鏈酶親和素(Streptavidin)與生物素(Biotin)*的高度親和力這一生物學(xué)性質(zhì)，先將生物素與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合，形成生物素化HRP，然后與鏈酶親和素按一定比例混合，形成SABC復(fù)合物。用生物素化二抗與第一抗體結(jié)合，

詳解PCR反應(yīng)條件的選擇2022/07/18

PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性）。1、變性溫度與時

ELISA組織樣本處理方法2022/07/05

用ELISA進行檢測的樣本類型包括常見的血液（血清、血漿），組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養(yǎng)上清以及不常見的皮膚組織、尿液、糞便、肺泡灌洗液、唾液、腦脊液、胸腹水、前列腺液、精液、陰道分泌物等，這些樣本收集的時間、處理方法和保存都會影響到ELISA實驗的結(jié)果。下面就常見ELISA組織樣本處理方法的整理，希望對您有所幫助。組織樣本一般是制成組織勻漿，處理方法如下:1、取適量組織塊，于預(yù)冷PBS（0.02mol/L,pH7.0-7.2）中清洗去除血液，稱重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；2、可同

論述PCR反應(yīng)條件的控制2022/06/28

PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三溫度點。在標準反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性）。PCR反應(yīng)條件的控

區(qū)分三種組成物質(zhì)化學(xué)成分不同細胞培養(yǎng)基2022/06/21

細胞培養(yǎng)基是人工模擬細胞在體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境，是提供細胞營養(yǎng)和促進細胞生長增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。培養(yǎng)液或培養(yǎng)基的含義幾乎相同，英文都是medium。當它是粉劑時，傾向性地稱為培養(yǎng)基，而將粉劑配成液體后，多稱為培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中常常補加血清、抗生素等成分。根據(jù)對培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分是否*了解來區(qū)分，可以將培養(yǎng)基分為：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基。1、天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基是指利用各種動、植物或微生物的原料，其成分難以確切知道。用作這種培養(yǎng)基的主要原料有：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩

傳代培養(yǎng)實驗操作步驟2022/06/14

實驗原理:傳代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一。也是幾乎所有細胞生物學(xué)實驗的基礎(chǔ)。當細胞在培養(yǎng)瓶中長滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細胞才能繼續(xù)生長。這一過程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量細胞供實驗所需。傳代要在嚴格的無菌條件下進行，每一步都需要認真仔細的無菌操作。傳代培養(yǎng)實驗操作步驟:1.入無菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒雙手。2.倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳代及細胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液置37℃下預(yù)熱。3.超凈臺臺面應(yīng)整潔，用0.1%新潔爾滅溶液擦凈。4.打開超凈臺的

解讀微生物菌種活化方式2022/06/07

菌種活化就是將保藏狀態(tài)的菌種放入適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，逐級擴大培養(yǎng)是為了得到純而壯的培養(yǎng)物，即獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物。菌種發(fā)酵有一般需要2-3代的復(fù)壯過程，因為保存時的條件往往和培養(yǎng)時的條件不相同，所以要活化,讓菌種逐漸適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境。要明白菌種活化的情況就需要了解菌種保藏的方式和方法。目前國際國內(nèi)常用的菌種保存方法包括：定期移植法、液體石蠟法、沙土管法、真空冷凍干燥法、80℃冰箱凍結(jié)法、液氮超低溫凍結(jié)法。對于不同的保存方式活化的方式也不同：1、定期移植法的菌種復(fù)蘇較簡單，直接轉(zhuǎn)接即可

解決PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)假陰性或無擴增產(chǎn)物2022/05/23

解決PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)假陰性或無擴增產(chǎn)物（即陽性對照中有條帶，而樣品則無條帶）方法：1、條帶放置時間過久,核酸被降解，最好在48h內(nèi)進行電泳檢測。2、DNA模板純度低，如含有雜蛋白質(zhì)或Taq酶抑制劑，可對DNA進行再次純化或重新用優(yōu)質(zhì)試劑盒提取DNA;DNA濃度太低時，可以加大模板量；對具有二級結(jié)構(gòu)DNA使用較好的聚合酶；提取DNA時，避免吸入酚類試劑。3、對設(shè)計不合理的引物進行重新設(shè)計合成；引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融而降解失效；檢測引物OD值并進行電泳檢測以確保兩條引物濃度一致。4、

了解細胞系用途2022/05/18

細胞系指原代細胞培養(yǎng)物經(jīng)首ci傳代成功后所繁殖的細胞群體，也指可長期連續(xù)傳代的培養(yǎng)細胞?，F(xiàn)在細胞系廣泛的應(yīng)用于科學(xué)研究和藥物，用途包括：1、科學(xué)研究：藥物研究開發(fā)與基礎(chǔ)研究藥物研究與開發(fā)（1）新藥篩選：如化學(xué)合成藥物藥效研究、中藥有效成分篩選與鑒定等。（2）疫苗研究與開發(fā)：如病毒性疫苗的研究與開發(fā)（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、腫瘤疫苗(多肽疫苗)等。（3）基因工程藥物研究與開發(fā)：如干擾素研究與開發(fā)，細胞生長因子研究與開發(fā)等。（4）細胞工程藥物研究與開發(fā)：生物活性多肽研究與開發(fā)，人參皂甙、紫杉醇

簡述大鼠褪黑素ELISA試劑盒使用指南2022/05/09

大鼠褪黑素ELISA試劑盒使用指南：1．試劑盒從冷藏箱里取出后放在常溫環(huán)境下15-30分鐘后再使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可以放在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。3．每一步步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間*控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4．請每次測定的同時做標準曲線，*做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高(樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值)，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)

ELISA試劑盒使用技巧大集合2022/05/05

ELISA試劑盒使用技巧大集合：1.洗液不夠時，可用蒸餾水自行配制PH7.4，0.02M的磷酸緩沖液，加入0.1%的吐溫20作為洗液。加入1/1000的疊氮鈉后可長期保存。2.吸取液體時，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。3.要盡量做雙孔實驗，這樣才既能保證數(shù)據(jù)的準確性，又能反映出試劑盒的精密度。4.為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜。5.未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。辣根過氧化物酶標記抗人IgG工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用

原代細胞培養(yǎng)實驗步驟2022/04/24

原代細胞培養(yǎng)實驗步驟：1、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。2、在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。3、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。4、用細解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。5、大腦皮質(zhì)放于DMEM中(含慶大霉素和谷氨酰胺)，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05

活性蛋白試劑盒提取操作步驟2022/04/19

本試劑盒用于從哺乳動物組織和培養(yǎng)細胞中提取具有活性的全蛋白，用含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液LysisBuffer勻漿裂解組織或細胞，作用溫和，提取過程簡便。獲得的全蛋白可用于WesternBlot、免疫共沉淀和酶的活性的測定的等后續(xù)研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究，因本試劑盒中包括這兩種酶的抑制劑。應(yīng)用方面：可用于WesternBlot、免疫共沉淀和酶活性測定等后續(xù)研究。操作步驟Ⅰ、實體組織蛋白的提取1、在每mL冷LysisBuffer加入10μL磷酸酶抑制劑，1μ

支原體污染細胞常用清除方法2022/04/13

支原體污染細胞后，有必要清除支原體，常用方法有：1、對于非重要的細胞，如培養(yǎng)中的細胞、WCB的細胞等，將培養(yǎng)物與用過的培養(yǎng)基滅活后丟棄即可。對于較為重要的細胞，如來源珍貴或?qū)嶒炇抑屑毎２亓枯^小等可以采用以下（2）-（8）的方法。2、用MRA處理：用支原體清除劑（MycoplasmaRemovalAgent）處理細胞，作用濃度為25μg/ml，兩周可以清除支原體。3、用清洗純化法清除支原體污染的方法：細胞營養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細胞群的篩選→細胞清洗→反復(fù)離心洗滌，其原理是利用離心力、細胞、微生物質(zhì)量和懸

PCR產(chǎn)物跑不出來條帶原因參考2022/03/23

PCR是分子生物學(xué)的常規(guī)和常用手段，用途很多，但是都是通過擴增目的基因片段來實現(xiàn)的。那么，首先需要搞明白的是，需要擴增的基因片段大小是多大，因為不同大小的基因片段其擴增的難度是有差異的，尤其過長的片段，需要使用不同的taq酶來進行擴增（比如LAtaq）。幾點容易發(fā)生問題的地方供參考：1.引物，PCR是基于引物來實現(xiàn)的。引物是否是自己設(shè)計的？如果是，需要檢查一下引物設(shè)計的是否合理。如果是從文獻中選取的，一般出問題的可能性不大，不放心的可以在數(shù)據(jù)庫比對一下，防止文獻出錯。2.模板，一般來講通過試劑盒

細胞因子一般具有的特點2022/03/15

細胞因子(cytokine，CK)是免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導(dǎo)多種細胞產(chǎn)生的低分子量可溶性蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫、血細胞生成、細胞生長、APSC多能細胞以及損傷組織修復(fù)等多種功能。細胞因子可被分為白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長因子等。眾多的細胞因子有以下共同的作用特點：1、絕大多數(shù)細胞因子為質(zhì)量小于25kDa的糖蛋白，質(zhì)量低者如IL-8僅8kDa。多數(shù)細胞因子以單體形式存在，少數(shù)細胞因子如IL-5、IL-12、M-CSF和TGF-β等以雙體

血清白蛋白主要有兩方面作用2022/03/07

雞血清蛋白（ChickenSerumAlbumin）是雞血清中的一種球蛋白，也是血清的主要成分.血液中的白蛋白主要起維持滲透壓作用、PH緩沖作用、載體作用和營養(yǎng)作用.在動物細胞無血清培養(yǎng)中，添加白蛋白可起到生理和機械保護作用和載體作用。無血清培養(yǎng)基(serumfreemedium,SFM)，是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的*培養(yǎng)基可以滿足大部分細胞培養(yǎng)的要求，但對有些實驗卻不適合，如觀察一種

關(guān)于實驗室化學(xué)試劑使用說明2022/03/07

國內(nèi)實驗室一般將化學(xué)試劑分為四個等級：一級試劑（優(yōu)級純試劑）通常用G.R表示。二級試劑（分析純試劑）通常用A.R表示。三級試劑（化學(xué)純）通常用C.P表示。四級試劑（實驗或工業(yè)試劑）通常用L.R表示。此外，根據(jù)特殊的工作目的，還有一些特殊的純度標準。例如光譜純、螢光純、半導(dǎo)體純等。取用時應(yīng)按不同的實驗要求選用不同規(guī)格的試劑。例如一般無機實驗用三級或四級試劑即可，分析實驗則需取用純度較高的二級甚至一級試劑?？蒲袕妱t中國強！上海撫生生物秉承“做陽光下的企業(yè)，做陽光下的人”的核心價值觀和“誠信、創(chuàng)新、奮

細胞進行爬片流程及注意事項2022/03/01

在做免疫熒光（IF），激光共聚焦(Confocal)，凋亡檢測（TUNEL）時，免不了要制備細胞爬片，爬片質(zhì)量*決定了最后拍照的質(zhì)量以及實驗數(shù)據(jù)的精準性?，F(xiàn)就如何制備好的細胞爬片介紹。細胞進行爬片操作流程：1.胰酶消化細胞后計數(shù)重懸細胞于*培養(yǎng)基中（懸浮細胞直接離心）。2.加細胞時，根據(jù)玻片的大小，先在每個孔里準備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基，目的是使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細胞懸液時玻片漂起，造成雙層細胞貼片。整個過程注意無菌操作。3.根據(jù)自己的需要選擇合適的細胞密