蛋白質(zhì)測序 Q＆A

Q1: 蛋白質(zhì)測序需要保持蛋白活性嗎？

A1: 不需要。蛋白質(zhì)測序關(guān)注的是氨基酸序列信息，而非蛋白的生物學(xué)功能。因此，無論采用Edman降解法還是質(zhì)譜法，測序過程中蛋白是否具有活性都不會影響序列結(jié)果。實際上，大多數(shù)測序流程（如還原、烷基化、酶切或電離）本身就會破壞蛋白活性結(jié)構(gòu)。因此，樣品只需結(jié)構(gòu)完整、無嚴重降解或污染即可，無需保持功能活性。

Q2: 在蛋白測序中如何選擇 Edman 降解法或質(zhì)譜法？

A2: 可根據(jù)樣品性質(zhì)與測序目的綜合判斷：

● 當樣品為高純度（>90%）的單一蛋白，且目標是明確N端序列（如驗證信號肽切除、N端起始點），優(yōu)先考慮Edman降解。Edman法適合讀出qián 10–30個氨基酸，但不適用于N端被修飾或阻斷的蛋白。

● 當樣品純度較低、含多種蛋白或目標未知時，選擇質(zhì)譜法，尤其適用于復(fù)雜混合物、蛋白指紋圖譜、全序列解析、翻譯后修飾檢測。質(zhì)譜不依賴N端、覆蓋范圍更廣，可結(jié)合數(shù)據(jù)庫進行高通量分析。

Q3: SDS-PAGE 凝膠上的蛋白質(zhì)條帶可以直接用于質(zhì)譜分析嗎？

A3：是的，SDS-PAGE 凝膠上的蛋白質(zhì)條帶可以用于質(zhì)譜分析，但必須先將其從凝膠上切下，用酶（例如胰蛋白酶）消化，然后才能進行分析。需要進行適當?shù)那逑春兔撋幚?，以去除可能干擾質(zhì)譜分析的污染物。

Q4：如果目標蛋白質(zhì)未知且其序列未在數(shù)據(jù)庫中找到，該怎么辦？

A4：在這種情況下，可以使用從頭測序。這種方法利用質(zhì)譜分析肽片段并組裝序列，無需依賴參考數(shù)據(jù)庫。它尤其適用于鑒定變體蛋白質(zhì)或非天然蛋白質(zhì)。多次酶切和高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜法可以提高序列覆蓋率和準確性。

Q5: 蛋白測序的策略有哪些?各自適用什么樣的研究需求？

A5: 蛋白測序主要有以下三種主要策略：

1、Bottom-up 測序

Bottom-up 是目前zuì cháng yòng的測序策略，將蛋白質(zhì)通過胰蛋白酶等酶解為短肽段后，利用LC-MS/MS進行肽段鑒定，再通過數(shù)據(jù)庫檢索或序列拼接還原蛋白結(jié)構(gòu)。該方法靈敏度高、通量大，適用于復(fù)雜樣本、蛋白混合物分析和大規(guī)模蛋白組研究。它可結(jié)合TMT、iTRAQ等標記方法實現(xiàn)相對定量，并能識別翻譯后修飾（如磷酸化、乙酰化等）。但由于需拼接重建，難以區(qū)分蛋白異構(gòu)體或完整修飾組合。

2、Top-down 測序

Top-down 方法直接對未經(jīng)酶解的完整蛋白進行高分辨率質(zhì)譜分析，解析其一級結(jié)構(gòu)及所有原位翻譯后修飾。該策略可完整保留修飾之間的共存信息，識別蛋白異構(gòu)體、剪接變體及復(fù)雜修飾模式，適合對結(jié)構(gòu)完整性要求高的研究，如抗體表征、蛋白藥物一致性分析、天然蛋白修飾圖譜構(gòu)建。但對質(zhì)譜性能、樣品純度和蛋白分子量的要求較高，通常用于單一或低復(fù)雜度樣品。

3、Middle-down 測序

Middle-down 是介于Top-down與Bottom-up之間的策略，通過限制性或非特異性酶將蛋白切割為中等長度（3–15?kDa）的片段，在保留部分結(jié)構(gòu)連續(xù)性的同時提升可解析性。該方法在抗體重鏈、復(fù)雜修飾區(qū)域或重復(fù)序列分析中具有優(yōu)勢，可提高序列覆蓋率、提升修飾解析精度，并降低Top-down對設(shè)備和樣品的要求。適用于對修飾結(jié)構(gòu)關(guān)系有一定需求但樣品條件不理想的項目。

Q6: 蛋白質(zhì)樣品準備過程中需要注意哪些事項？

在蛋白質(zhì)樣品準備過程中，需特別注意避免引入外來污染，因微量的污染蛋白可能影響質(zhì)譜鑒定的準確性。應(yīng)使用干凈無污染的器皿和高純度試劑，溶液需新鮮配制，并且操作人員必須佩戴手套和頭套，防止角蛋白等污染物對樣品造成干擾。

Q7: 全長蛋白質(zhì)測序可以檢測翻譯后修飾嗎?

A7: 可以。全長蛋白質(zhì)測序通過高分辨質(zhì)譜技術(shù)（如Top-down或Middle-down MS）可在原位識別并定位蛋白質(zhì)上的翻譯后修飾，如磷酸化、乙?；?、甲基化、糖基化和泛素化等。相較于傳統(tǒng)的Bottom-up方法，全長測序保留了修飾的上下文結(jié)構(gòu)信息，適合研究修飾的協(xié)同作用與構(gòu)象調(diào)控。

不過，檢測PTMs對儀器分辨率、樣品復(fù)雜度和數(shù)據(jù)分析要求較高。對于低豐度或多位點修飾，建議結(jié)合專一性富集策略（如TiO?富集磷酸化肽段），以提升檢測靈敏度和修飾位點覆蓋率。

Q8: 可以對蛋白質(zhì)測序結(jié)果進行哪些分析？

A8: 蛋白質(zhì)測序結(jié)果支持廣泛的下游分析，有助于揭示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、修飾和生物學(xué)作用。常見的分析包括：

1、序列比對——識別同源蛋白，推斷其功能和進化關(guān)系。

2、功能域和活性位點預(yù)測——檢測對蛋白質(zhì)活性至關(guān)重要的保守結(jié)構(gòu)域和催化殘基。

3、3D結(jié)構(gòu)預(yù)測——構(gòu)建蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型，了解分子相互作用和構(gòu)象動力學(xué)。

4、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析——探索相互作用伙伴，繪制細胞通路和蛋白質(zhì)復(fù)合物圖譜。

5、翻譯后修飾 (PTM) 定位——定位磷酸化或泛素化等修飾，并研究其功能影響。

6、表達譜分析——評估不同組織、時間點或疾病狀態(tài)下的差異蛋白表達。

7、通路整合——將蛋白質(zhì)整合到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或代謝通路中，以了解其調(diào)控作用。

8、進化分析——分析序列的保守性和分化性，以追蹤功能進化。

9、生物標志物發(fā)現(xiàn)——識別用于疾病診斷、預(yù)后或治療靶向的候選蛋白質(zhì)。

Q9: 如何驗證蛋白測序的結(jié)果？

A9: 常見的驗證方法包括：

1、免疫印跡（Western blot）：使用特異性抗體確認目標蛋白是否存在并與測序結(jié)果分子量一致。

2、分子量比對：將理論分子量與SDS-PAGE或質(zhì)譜測得的分子量進行比對。

3、突變驗證表達：構(gòu)建帶突變的表達載體，通過表達產(chǎn)物測序驗證關(guān)鍵氨基酸位點。

4、功能驗證：若目標蛋白具有明確功能，可通過功能實驗間接支持測序正確性（如酶活、結(jié)合能力等）。

綜合使用多種驗證手段有助于提高蛋白測序結(jié)果的置信度和實驗可靠性。

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