蛋白質(zhì)組定量中的LFQ與同位素標記策略

定量蛋白質(zhì)組學在當代生命科學研究中扮演著關(guān)鍵角色，幫助研究人員深入了解生理或病理狀態(tài)下細胞系統(tǒng)的動態(tài)調(diào)控機制。不同于僅關(guān)注蛋白種類的“鑒定"，蛋白質(zhì)定量的核心在于測量蛋白豐度的變化，從而揭示差異表達、翻譯后修飾及信號通路響應等關(guān)鍵生物學現(xiàn)象。

目前，最常采用的兩類基于質(zhì)譜（MS）的蛋白質(zhì)定量策略為：無標記定量（Label-Free Quantification, LFQ）與等重同位素標記法（如Tandem Mass Tags, TMT；以及iTRAQ）。這兩種方法各具優(yōu)勢和局限，適用性依賴于實驗設計、樣本類型及分析目標。

Calvete, JJ. et al. Mass Spectrom Rev. 2024.

圖1. 不同定量蛋白質(zhì)組學策略的綜合比較

一、非標記定量 (LFQ)

無標記定量是一種應用廣泛的質(zhì)譜定量策略，通過測量LC-MS分析中肽段離子信號強度或譜圖計數(shù)來估算蛋白質(zhì)豐度。該方法基于一個核心假設：肽段的離子信號強度與其在樣本中的濃度成正比。在常規(guī)LFQ流程中，蛋白質(zhì)首先經(jīng)酶解為肽段，隨后通過液相色譜分離，并由高分辨率質(zhì)譜進行檢測。樣本間的定量比較通常依賴于軟件對保留時間的比對與信號強度的歸一化處理。

Sulaj E, et al, 2024.

圖2. LFQ定量工作流程

優(yōu)點：

1、無需化學標記：不依賴外源標簽，避免了標記效率差異帶來的誤差。

2、成本較低：無需購買標記試劑，適合大樣本量或預算有限的探索性研究。

3、樣本靈活性高：可直接用于體液、組織或FFPE樣本，無需特殊預處理。

4、廣泛動態(tài)范圍：可捕捉從高豐度到低豐度蛋白的變化趨勢，適用于復雜生物樣本。

由于LFQ無需進行化學或代謝標記，具備成本低、操作靈活的優(yōu)勢，尤其適用于樣本數(shù)量較大或不適合進行標記的研究場景，如臨床組織或體液樣本。但該方法對批次間的分析波動較為敏感，因此需要借助穩(wěn)健的數(shù)據(jù)歸一化與統(tǒng)計分析方法，以確保定量結(jié)果的準確性和可比性。

二、同位素標記 (TMT/iTRAQ)

等重同位素標記方法（如TMT和iTRAQ）通過將不同樣本來源的肽段共價連接上化學性質(zhì)相同但同位素組成不同的標簽實現(xiàn)定量。這些標簽在質(zhì)譜一級掃描中表現(xiàn)為相同的前體離子質(zhì)量，但在MS/MS碎裂過程中可釋放出具有不同質(zhì)量的報告離子，從而實現(xiàn)多樣本間的相對定量。在標記完成后，所有樣本混合并在一次LC-MS/MS分析中共同檢測，極大提高了實驗效率和數(shù)據(jù)一致性。

圖3. TMT標記定量蛋白組學工作流程

優(yōu)勢：

1、高通量多重分析：一次可同時分析6–18個樣本，提高實驗效率與一致性。

2、數(shù)據(jù)可比性強：所有樣本共上機，消除技術(shù)間變異，適用于時間梯度或組學分組設計。

3、定量精度高：定量比較在同一次運行中完成，適合需要嚴格比較的差異分析項目。

4、適合復雜實驗設計：支持多個實驗組、多個處理條件同時對比分析

等重標記法的一大優(yōu)勢在于高通量多重分析（multiplexing）能力，可根據(jù)試劑類型實現(xiàn)6至18個樣本的同步定量，且具有較高的定量精度和較低的技術(shù)波動，特別適用于對樣本間可比性要求較高的研究，如時間梯度實驗或患者隊列分析。然而，該方法在MS2水平上定量時，容易受到共洗脫肽段的共隔離與共碎裂影響，導致比例失真（ratio distortion），因此在某些實驗中需結(jié)合MS3或SPS-MS3等校正策略以提升定量準確性。

三、使用場景對比：不同情況下該選哪種方法

1、異質(zhì)性臨床樣本的探索性蛋白質(zhì)組學研究 → 優(yōu)先選擇 LFQ

在早期的發(fā)現(xiàn)性研究中，常涉及來源復雜、樣本量有限的臨床樣本（如患者組織、血清、腦脊液等）。此類樣本通常難以進行化學標記，LFQ作為一種無需標記的策略，可直接進行分析，極大提高樣本適應性。同時，LFQ具備較寬的動態(tài)范圍，適合同時檢測高豐度與低豐度蛋白。但需特別注意歸一化與質(zhì)控流程，以保證數(shù)據(jù)準確性。

案例：Identifying potential biomarkers in plasma samples from a small cohort of disease and control subjects.

在2024年發(fā)表的一項研究中，研究團隊采用Label-Free Quantification（LFQ）質(zhì)譜技術(shù)，系統(tǒng)分析了肥胖患者在接受利拉魯肽（liraglutide）治療前后的血漿蛋白表達變化。研究納入20例患者，比較治療前后血漿樣本，共鑒定出1,019個蛋白，其中151個為顯著差異蛋白，涉及糖脂代謝、炎癥反應、氧化應激和細胞骨架等通路。研究發(fā)現(xiàn)，治療后多種炎癥和代謝相關(guān)蛋白顯著調(diào)控，提示利拉魯肽可能通過多通路改善代謝狀態(tài)。該研究充分展示了LFQ技術(shù)在異質(zhì)性臨床樣本、樣本量有限、標記難度大的背景下的廣泛適用性和出色表現(xiàn)。與TMT等標記方法相比，LFQ在此類早期探索性研究中操作更簡便、適應性更強，并通過標準化歸一化流程有效保障了數(shù)據(jù)的可比性與定量準確性。

圖4. 對PoT組和PT組肥胖患者的蛋白質(zhì)組學譜進行多變量分析

圖5. 對已鑒定出顯著變化的蛋白質(zhì)進行火山圖、層次聚類 (HAC) 和熱圖分析

2、多種條件的大規(guī)模比較研究 → 推薦使用 TMT/iTRAQ

在需同時比較多個實驗條件或生物學重復的研究中，如藥物篩選、劑量梯度測試或時間序列分析，等重標簽法具備顯著優(yōu)勢。TMT等方法可實現(xiàn)6至18個樣本在同一次LC-MS/MS運行中共同分析，大幅降低批次效應，提高定量一致性與效率。

案例： Expanding the landscape of aging via orbitrap astral mass spectrometry and tandem mass tag integration

在2025年發(fā)表于《Nature Communications》的這項研究中，研究團隊結(jié)合Orbitrap Astral高分辨質(zhì)譜儀與TMT 18-plex等重標記技術(shù)，對不同年齡階段小鼠多組織樣本（皮質(zhì)層、海馬體、紋狀體和腎臟）進行系統(tǒng)性蛋白質(zhì)組學分析。該研究通過單次LC-MS/MS運行實現(xiàn)18個樣本的同步分析，顯著降低批次效應，并實現(xiàn)對超過12,000個蛋白的高深度、定量一致性分析。結(jié)果揭示了多組織中蛋白隨年齡變化的線性與非線性規(guī)律，特別是在大腦區(qū)域和腎臟中觀察到明顯的組織特異性與性別差異表達模式。該研究充分展示了TMT多重標記策略在多條件、大規(guī)模比較研究中的優(yōu)勢，為衰老機制解析提供了重要的蛋白質(zhì)組學依據(jù)。

Keele, G.R. et al. Nat Commun. 2025.

圖6. 肽段過濾結(jié)合 Orbitrap Astral 可顯著提升TMT定量的準確性

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