人促黃體生成素 ELISA 試劑盒工作原理拆解：從 LHB 表位到信號放大

1. 目標(biāo)分子畫像：LH 不是單體，是 αβ 異二聚體

LH 由 92 aa 的 α 亞基（與 hCG/FSH/TSH 共用）和 121 aa 的 β 亞基（LHB 基因編碼）非共價結(jié)合而成。

試劑盒只測 β 鏈：抗體對鎖定 β 亞基 39–52 與 93–105 兩段有表位，避開 α 交叉，F(xiàn)SH 500 mIU/mL、TSH 1000 μIU/mL 干擾 < 0.05 %。

2. 夾心架構(gòu)：配對抗體如何錨定“活"的 β 亞基

• 捕獲抗體：小鼠抗人 LHβ mAb，克隆 125B，IgG1κ，包被濃度 2.5 μg/mL，定向吸附在 96 孔高結(jié)合力聚苯乙烯板，4 ℃ 16 h 完成取向排列。

• 檢測抗體：生物素化兔抗 LHβ pAb，生物素/Ab 摩爾比 3.2，標(biāo)記后親和力下降 < 10 %，保證高劑量端不“鉤狀"。

• 鏈霉親和素-HRP：SA 與生物素 4:1 結(jié)合，等效放大 4 個 HRP，信號增益 3.2 倍，TMB 底物 10 min 內(nèi) OD 650 可達(dá) 2.0。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品溯源：WHO 2nd IS 80/552 如何“活"在板孔里

凍干標(biāo)準(zhǔn)品用 0.5 % BSA-PBS 復(fù)溶，每批與 2nd IS 平行比對，斜率 0.98–1.02 放行。

穩(wěn)定性：分裝 ?70 ℃ 保存，6 個月內(nèi)偏差 ≤ 5 %；復(fù)溶后 4 ℃ 僅穩(wěn) 48 h，超期 β 亞基解離，活性下降 7 %。

4. 信號級聯(lián)：從 HRP 到藍(lán)色產(chǎn)物的一步放大

TMB 底物 A 液含 0.4 g/L 四甲基聯(lián)苯胺，B 液 0.02 % H?O?，pH 3.8。

反應(yīng)動力學(xué)：

• 25 ℃ 下 Vmax 0.12 OD/s，10 min 進(jìn)入線性末段，硫酸終止后 450 nm 摩爾吸光系數(shù) 59 000 M?1cm?1，1 mIU/mL LH 對應(yīng) OD 0.008，儀器 0.001 分辨率足夠區(qū)分零孔。

5. 背景控制：阻斷劑把“空白"壓到 0.04 OD

• 板內(nèi)預(yù)封閉 1 % Casein-PBS 1 h，阻斷非特異疏水位點。

• 酶結(jié)合物稀釋液含 0.15 M NaCl + 0.05 % Tween-20，降低靜電吸附。

• 實測 40 例 LH < 0.5 mIU/mL 去激素血清，平均 OD 0.038，±2SD 0.045，靈敏度 0.8 mIU/mL 由此算出。

6. 干擾實驗：溶血、脂血、生物素怎么破

• 溶血 Hb 1 g/L 使 OD 升高 0.012，換算假陽性 1.5 mIU/mL，肉眼可見粉紅色即棄。

• TG 5 mmol/L 濁度 350 NTU，OD 450 飄高 0.008，高速離心 10 000 ×g 10 min 可去。

• 血清生物素 > 30 ng/mL（常見于美發(fā)護(hù)膚補劑）搶占 SA，信號被“中和"，稀釋 1∶4 后回測，回收率 92 %。

7. 反應(yīng)條件：25 ℃ 慢溫 vs 37 ℃ 快溫

• 37 ℃ 30 min 信號高 18 %，背景也高 0.015，CV 從 5 % 升到 8 %。

• 25 ℃ 60 min，板間溫差 ≤1 ℃，背景穩(wěn)在 0.04，適合多中心比對。

• 振蕩 400 rpm 可讓低值區(qū) OD 再抬 0.02，靈敏度逼近 0.5 mIU/mL，但高值易 hook，需把上限從 1000 降到 800 mIU/mL。

8. 一步法 vs 兩步法：速度換特異

• 一步法 45 min 出結(jié)果，F(xiàn)SH 交叉 0.3 %，適合急診。

• 兩步法先捕獲 60 min→洗→檢測 60 min，F(xiàn)SH 交叉降到 0.05 %，科研或 IVF 精確采樣優(yōu)選。

• 同一抗體對，兩步法信號強度提高 28 %，代價是總時長翻倍。

9. 結(jié)果換算：從 OD 到 mIU/mL 的四參數(shù)方程

用 4PL 擬合，引入不對稱因子 g，解決低值 0–15 mIU/mL 區(qū)段 S 形下壓。

公式：

y = ((A-D)/(1+(x/C)^B)^g) + D

A=OD 0，D=OD 最大，B=斜率，C=EC50，g 0.95–1.05。

R2 ≥ 0.998，殘差 < 2 %，才能通過 LIMS 自動審核。