2025版《中國(guó)藥典》解讀 | “分子學(xué)解碼"第二期：實(shí)時(shí)熒光定量PCR新規(guī)解讀

分子學(xué)解碼

實(shí)時(shí)熒光定量PCR新規(guī)

修訂解讀

隨著《中國(guó)藥典》1001 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法修訂稿的公示，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）技術(shù)正式成為藥品質(zhì)量控制的關(guān)鍵手段之一。

PART 1

新規(guī)聚焦：藥典第二法實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 核心要求

《中國(guó)藥典》1001聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法修訂稿系統(tǒng)性地引入了第二法：實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（Real-time qPCR），明確了其在藥品質(zhì)量控制中的重要地位，尤其適用于：

●  定性/定量檢測(cè)： 動(dòng)/植物源性中藥材、飲片、原材料、中間體、原料藥、輔料及生物制品中的特定核酸成分。

●  關(guān)鍵應(yīng)用： 種屬鑒定、雜質(zhì)殘留檢測(cè)、基因表達(dá)分析等。

為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，新規(guī)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法提出了嚴(yán)格的技術(shù)要求：

1.儀器要求

●  具備精確的溫度控制能力（變性、退火/延伸等步驟）。

●  需配置與檢測(cè)要求相匹配的熒光激發(fā)與信號(hào)讀取模塊（支持染料法或探針?lè)ǎ?/span>

2.試劑要求

●  核心組分：耐熱 DNA 聚合酶、緩沖液、dNTP、引物、模板。

● 探針?lè)ㄐ锜晒鈽?biāo)記探針，染料法需合適的熒光染料。

●  試劑需經(jīng)驗(yàn)證或質(zhì)量確認(rèn)（自制、商品化試劑或?qū)Ｓ迷噭┖校?/span>使用過(guò)程嚴(yán)防污染。

●  RNA 檢測(cè)需特別注意無(wú) RNase 環(huán)境和快速滅活 RNA 酶。

3.測(cè)定法核心流程

●供試品前處理： 按品種要求進(jìn)行（同第一法常規(guī) PCR）。

●嚴(yán)格的對(duì)照設(shè)置：

? 陽(yáng)性對(duì)照： 含目標(biāo)片段且與樣品類(lèi)型一致（定量時(shí)濃度/拷貝數(shù)需確認(rèn)）。

? 加標(biāo)對(duì)照： 加入陽(yáng)性對(duì)照的待測(cè)樣品，驗(yàn)證回收率。

? 陰性對(duì)照： 不含目標(biāo)片段且與樣品類(lèi)型一致。

●模板制備：

? DNA 提取質(zhì)量要求（OD260/OD280: 1.5-2.5； OD260/OD230: 2-3）。

? RNA 提取要求更高（OD260/OD280: 1.8-2.1； OD260/OD230 ≥ 1.7），需逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。

●引物與探針： 序列按品種/通則規(guī)定。

●核酸擴(kuò)增： 反應(yīng)體系組成、循環(huán)程序需符合規(guī)定，探針?lè)ㄐ枳x取延伸后熒光，染料法需進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析。

● 數(shù)據(jù)獲?。?/span> 設(shè)定合理的熒光閾值（Ct值）。

● 系統(tǒng)適用性要求：

? 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)： 至少 5 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)濃度梯度。擴(kuò)增效率(E%)必須達(dá)到 85%-110%（斜率Slope: -3.10 ~ -3.74）。決定系數(shù)（R2）**≥ 0.98**。

? 對(duì)照組： 陽(yáng)性對(duì)照必須為陽(yáng)性；加標(biāo)對(duì)照回收率 50%-150%；陰性對(duì)照應(yīng)無(wú) Ct 值或 Ct 值不低于濃度標(biāo)準(zhǔn)品。

? 重復(fù)性： 陽(yáng)性對(duì)照及樣品復(fù)孔的 RSD ≤ 30%。

? 熔解曲線(xiàn)（染料法）： 陽(yáng)性對(duì)照及標(biāo)準(zhǔn)品熔解曲線(xiàn)需為單一尖銳峰，待測(cè)樣品Tm值需符合規(guī)定。

? 數(shù)據(jù)分析： 支持定性、絕對(duì)定量和相對(duì)定量分析（需內(nèi)參基因歸一化）。

4.方法驗(yàn)證要求

● 新方法需進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證，驗(yàn)證指標(biāo)（專(zhuān)屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線(xiàn)性、范圍、檢測(cè)限等）需與方法用途匹配。

5.實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求

●  需符合國(guó)家生物安全管理要求。

●  嚴(yán)格分區(qū)（試劑配制、模板制備、擴(kuò)增、產(chǎn)物分析），嚴(yán)防交叉污染。

●  推薦參照 CNAS-GL029《基因擴(kuò)增領(lǐng)域檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可指南》 等規(guī)范進(jìn)行管理。

總結(jié)新規(guī)關(guān)鍵點(diǎn)： 高精度溫控、穩(wěn)定熒光檢測(cè)、嚴(yán)格系統(tǒng)適用性（效率、線(xiàn)性、重復(fù)性、熔解曲線(xiàn)）、合規(guī)實(shí)驗(yàn)室管理是成功實(shí)施藥典實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的核心要素。

PART 2

賽默飛 QuantStudio：滿(mǎn)足藥典嚴(yán)苛要求的完整 qPCR 解決方案

面對(duì)《中國(guó)藥典》對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 提出的高要求、高標(biāo)準(zhǔn)，賽默飛世爾科技提供全系列的 QuantStudio™ 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，助您輕松合規(guī)，結(jié)果精準(zhǔn)！

賽默飛QutantStudio qPCR

系統(tǒng)關(guān)鍵特性對(duì)比表

PART 3

應(yīng)用場(chǎng)景：QuantStudio 助力藥品全流程質(zhì)控

● 中藥材/飲片種屬鑒定： 利用探針?lè)ǘ刻禺愋?DNA 片段，準(zhǔn)確鑒別烏梢蛇、蘄蛇、金錢(qián)白花蛇、川貝母、霍山石斛等，以及豬、牛、羊源性成分。

● 原材料/輔料溯源與污染監(jiān)控： 檢測(cè)動(dòng)植物源性原料真實(shí)性，監(jiān)控微生物污染（如支原體）。

●生物制品宿主殘留 DNA 檢測(cè)： 高靈敏度定量生產(chǎn)過(guò)程中殘留的宿主細(xì)胞 DNA。

● 基因工程藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)： 分析治療性蛋白的表達(dá)水平。

●  方法開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證： QuantStudio系列產(chǎn)品的高性能和靈活性是開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證符合藥典要求的新qPCR方法的可靠平臺(tái)。

《中國(guó)藥典》1001 通則對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 法的規(guī)范化，標(biāo)志著藥品核酸檢測(cè)邁入新階段。賽默飛世爾科技 QuantStudio 系列實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 系統(tǒng)，憑借其性能、靈活的配置、強(qiáng)大的合規(guī)性支持以及完善的服務(wù)，是您應(yīng)對(duì)新規(guī)挑戰(zhàn)、提升藥品檢測(cè)能力、確保結(jié)果精準(zhǔn)合規(guī)的值得信賴(lài)的合作伙伴。

尾聲

我們將對(duì)整個(gè)藥典第四部與分子學(xué)相關(guān)的內(nèi)容進(jìn)行解析，歡迎大家繼續(xù)關(guān)注！

拓展閱讀

2025 版《中國(guó)藥典》解讀 | “分子學(xué)解碼"系列第一期