做重組蛋白實驗時，你是否也糾結(jié)過：大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞…… 到底哪種表達系統(tǒng)才適合自己的目標(biāo)蛋白？別再盲目試錯！《STAR Protocols》發(fā)布的這份由 60 多位歐洲蛋白質(zhì)生產(chǎn)專家參與制定的指南，幫你理清選擇邏輯，高效鎖定方案。

先明確核心：蛋白特性決定系統(tǒng)

選系統(tǒng)前，先搞懂目標(biāo)蛋白的 “基本信息"，這是關(guān)鍵前提。你可以通過查閱文獻、Uniprot 數(shù)據(jù)庫，或用 ProtParam、AlphaFold 等工具，獲取這些關(guān)鍵信息：

天然定位：是細胞內(nèi)蛋白、分泌蛋白還是膜蛋白？

結(jié)構(gòu)特征：分子量大小、單 / 多結(jié)構(gòu)域、二硫鍵數(shù)量；

修飾需求：是否需要糖基化等翻譯后修飾；

穩(wěn)定性：是否需與其他亞基共表達才能穩(wěn)定。

4步?jīng)Q策法：從 “候選" 到 “優(yōu)"

圖1 蛋白表達系統(tǒng)選擇決策方案

第1步：按蛋白來源初步篩選

原核蛋白：優(yōu)先選大腸桿菌！它操作簡單、成本低、速度快，大部分原核蛋白都能搞定，是實驗室 “老朋友"。

真核蛋白：需進一步判斷蛋白的修飾和結(jié)構(gòu)需求，不能直接套用原核系統(tǒng)。

第2步：根據(jù)蛋白關(guān)鍵特征縮小范圍

這一步要重點關(guān)注 3 個核心指標(biāo)，決定是否能繼續(xù)用大腸桿菌，還是必須轉(zhuǎn)向真核系統(tǒng)：

二硫鍵數(shù)量：≤3 個，且無需翻譯后修飾，可嘗試大腸桿菌（需選能促進細胞質(zhì)二硫鍵形成的菌株，或分泌到周質(zhì)空間）；＞4 個，直接排除原核，選真核。

分子量：單蛋白 / 復(fù)合物≤100kDa，大腸桿菌有機會成功；＞100kDa，真核系統(tǒng)（酵母、昆蟲、哺乳動物細胞）更靠譜。

膜蛋白復(fù)雜度：小型整合膜蛋白可試大腸桿菌；復(fù)雜膜蛋白（如 G 蛋白偶聯(lián)受體、離子通道），直接選昆蟲細胞或哺乳動物細胞，這兩類系統(tǒng)能更好支持膜蛋白折疊與功能維持。

第3步：真核系統(tǒng)內(nèi)部 “細選"，看糖基化需求

若確定用真核系統(tǒng)，糖基化類型是核心區(qū)分點：

酵母系統(tǒng)（如畢赤酵母）：適合不需要復(fù)雜糖基化的場景。它能高密度發(fā)酵，產(chǎn)量高，還能分泌蛋白，無脂多糖污染，常用于生產(chǎn)細胞因子（如 IL-3）、抗體衍生物（納米抗體、雙特異性抗體），成本比哺乳動物細胞低不少。

昆蟲細胞系統(tǒng)（桿狀病毒介導(dǎo)為主）：擅長生產(chǎn)膜蛋白、多亞基復(fù)合物和病毒樣顆粒（VLPs）。它能進行低甘露糖型糖基化，若需接近哺乳動物的糖基化，可通過共表達相關(guān)酶改造。另外，昆蟲細胞瞬時表達（TGE）一周內(nèi)可出結(jié)果，適合快速驗證。

哺乳動物細胞系統(tǒng)（HEK293、CHO 細胞為主）：能提供最貼近天然的翻譯后修飾（尤其是復(fù)雜型 N - 聚糖），是藥用蛋白、需要功能性修飾的真核蛋白的第一選擇。HEK293 細胞轉(zhuǎn)染效率高，適合研究用；CHO 細胞穩(wěn)定性好，常用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。

第4步：結(jié)合生產(chǎn)需求定最終方案

短期少量需求（如快速驗證實驗）：選瞬時表達系統(tǒng)，比如昆蟲細胞 TGE、哺乳動物細胞 TGE，無需構(gòu)建穩(wěn)定細胞系，一周內(nèi)即可獲得蛋白。

長期大量生產(chǎn)（如后續(xù)實驗持續(xù)用）：建議投入時間構(gòu)建穩(wěn)定細胞系（哺乳動物系統(tǒng)）或桿狀病毒系統(tǒng)（昆蟲細胞），雖然前期耗時，但后續(xù)產(chǎn)量穩(wěn)定，長期成本更低。

特殊情況：這些 “小眾" 系統(tǒng)也有用

如果遇到常規(guī)系統(tǒng)搞不定的情況，也可以考慮這些選項：

無細胞表達系統(tǒng)：適合有毒蛋白、膜蛋白，或只需微克級蛋白的場景，能靈活添加配體、穩(wěn)定劑，但操作需專業(yè)培訓(xùn)，成本較高。

植物 / 特殊細菌系統(tǒng)：如乳酸乳球菌、枯草芽孢桿菌，適合特定研究需求，建議先咨詢領(lǐng)域?qū)＜以賴L試

基因表達系統(tǒng)的關(guān)鍵特征和評分

該指南比較了基因表達系統(tǒng)的常用的關(guān)鍵特征，包括：

易用性：使用特定基因表達系統(tǒng)所需的經(jīng)驗/培訓(xùn)程度。

速度：從質(zhì)粒DNA/表達構(gòu)建到蛋白表達出來所需的時間。

蛋白質(zhì)生產(chǎn)能力：細胞內(nèi)平均蛋白生產(chǎn)能力（mg/L）。

蛋白質(zhì)分泌：每升培養(yǎng)物中分泌型蛋白質(zhì)的平均生產(chǎn)能力范圍。

蛋白質(zhì)折疊和組裝：產(chǎn)生功能性和正確折疊蛋白質(zhì)的能力。

成本效率：生產(chǎn)單位產(chǎn)量的蛋白所消耗的成本。

每個特征的評分標(biāo)準(zhǔn)基于正面的表現(xiàn)來進行，即更高的分數(shù)對應(yīng)于更有益的產(chǎn)出。

圖2 與主要蛋白表達系統(tǒng)相關(guān)的特征的雷達圖

最后劃重點

沒有 “萬能" 的表達系統(tǒng)，關(guān)鍵是讓目標(biāo)蛋白特性、生產(chǎn)需求、計劃的下游應(yīng)用與系統(tǒng)優(yōu)勢匹配，也應(yīng)該考慮擁有的專業(yè)技術(shù)和設(shè)備的可獲得性。收藏這份策略，下次選系統(tǒng)不用再糾結(jié)啦！

賽默飛熱銷蛋白表達系統(tǒng)