什么是流式補償？

流式細胞儀可以同時檢測多個靶標，這是通過用不同熒光染料標記的抗體來實現(xiàn)的。雖然每種熒光染料都被設計為由特定波長的激光激發(fā)，并發(fā)射出特定波長范圍的光，然而不同熒光染料的發(fā)射光波長范圍會有重疊，這就是光譜重疊（圖1）。而流式補償就是一個在流式細胞分析中，用于校正熒光染料光譜重疊的數(shù)學過程，從而消除不同熒光染料發(fā)射光譜重疊帶來的信號溢出，以確保檢測到的信號真實來源于目標熒光團，從而獲得準確的多色流式數(shù)據(jù)。

圖 1. 熒光光譜查看器顯示的FITC，PE， PerCP-Cy5.5，APC （由左至右）四色組合。 

流式補償能不能不調(diào)？

現(xiàn)在流式實驗使用的熒光染料越來越多，光譜重疊越來越復雜，而補償對于解析這種復雜的數(shù)據(jù)、從單個細胞中獲取準確的多參數(shù)信息是不能缺少的。如圖2中所呈現(xiàn)的，不做補償或者沒有正確的補償，看到的數(shù)據(jù)是失真的，會導致錯誤的生物學解釋和結(jié)論。Dr.賽建議Flowers絕大部分情況下流式實驗都要進行補償調(diào)節(jié)。

圖 2. 不同補償設置對于流式實驗結(jié)果的影響。

當然，如果能夠確定所使用的染料之間沒有光譜重疊的話，理論上確實是可以不調(diào)節(jié)補償?shù)?。所以?/span>Flowers要充分了解流式細胞儀的配置和染料的光譜，選擇染料的時候需與儀器配置兼容，可以通過激光器優(yōu)化選擇來減少染料的信號溢漏。

流式補償調(diào)好之后能不能一直用呢？

同一個方案需不需要每次都調(diào)？

得到的補償值是基于特定的電壓設置、抗體/染料組合、儀器狀態(tài)和單染樣本等等計算出來的，這些因素中的任何一個發(fā)生變化，補償值就可能發(fā)生改變。如果依然沿用舊的補償設置，很可能導致數(shù)據(jù)失真。所以，將“每次實驗都調(diào)節(jié)補償"作為一個必須遵守的標準操作規(guī)程，可以避免大部分因補償不當導致的數(shù)據(jù)失真。

調(diào)節(jié)補償?shù)膯稳緦φ杖绾卧O置呢？

目前大部分流式細胞儀都支持自動補償，軟件操作因儀器不同而不同。Dr.賽這里主要想給Flowers介紹一下，如何針對補償準備對照，也就是常說的補償單染管。流式補償單染管需要遵循以下幾個原則：

1.多色實驗時，所有熒光染料必須各自做一個單染管，補償單染管和樣本染色要使用同一管抗體。

2.為了補償計算準確，補償單染管最好有明顯的陽性群和陰性群，且能夠收集到足夠的顆粒數(shù)量。如果細胞沒有明顯陽性群或者靶標表達很弱，可以使用流式補償微球替代細胞制備補償單染管。

點擊圖片, 查看流式補償微球干貨知識

3.補償單染管信號與實驗樣本信號相比，要一樣強或者更強。

4.補償調(diào)節(jié)和樣本上機時的熒光通道的電壓設置必須保持一致。如果樣本上機時發(fā)現(xiàn)熒光通道的電壓需要調(diào)整，那么電壓調(diào)整好后，所有通道補償需要重新調(diào)節(jié)。

5. 補償單染管與樣本的制備過程需要保持一致，每一個實驗環(huán)節(jié)都有可能對熒光染料產(chǎn)生影響，從而影響補償數(shù)值。例如，表面染色CD4之后需要固定破膜再染色胞內(nèi)靶標，作為CD4的單染補償染色后也需要進行固定破膜操作，從而跟樣本保持一致。

流式補償數(shù)值超過100%或者為負值是否正常？

因為補償是一個數(shù)學過程，所以數(shù)值超過100%或者為負值都是有可能的。超過100%是比較常見的狀況，這提示有可能光譜重疊導致的熒光溢漏比較嚴重，通過更高的補償值來減去溢出信號。這也通常能夠提醒Flowers流式方案的設計和染料的選擇可能需要優(yōu)化，或者儀器的設置尤其是熒光通道的電壓設置需要優(yōu)化。當然，即便補償值超過100%，只要調(diào)節(jié)合適，也是可以的。而補償值是負值的情況確實是不太常見的，往往提示實驗流程中可能存在需要排查的問題，比如陽性群和陰性群存在差異顯著的自發(fā)熒光，圈門有問題，儀器電壓設置問題，串聯(lián)染料的斷裂等等。

哪些染料之間的補償值比較大，不建議同時使用？

流式實驗中熒光染料的光譜重疊往往無法避免，尤其是對于多色流式實驗，很多光譜重疊造成的影響可以通過優(yōu)化配色方案和補償來減小。但是，確實有些染料，由于光譜重疊過于強，要特別注意這些染料同時使用時的補償調(diào)節(jié)。比如，APC與PE-Cy5；BV711，AF700，PE-Cy5.5，PerCP-Cy5.5； AMCyan和FITC等。還有很多染料，光譜極其接近，在傳統(tǒng)流式細胞儀上是同一個通道檢測的，這些染料是不能同時使用的。比如，FITC和AF488；APC， AF647和eFluor660；eFluor450，BV421和Super Bright 436；PE-eFluor610和PE-CF594；PerCP-Cy5.5和PerCP-eFluor710等。這類染料還有很多，針對自己不熟悉的染料，可以通過熒光光譜查看器和流式染料通道選擇指南來了解染料的光譜信息和對應檢測通道。

光譜流式細胞儀是不需要進行補償調(diào)節(jié)嗎？

Dr.賽這里講的補償內(nèi)容都是針對于傳統(tǒng)流式細胞儀的。對于光譜流式來說，是不存在補償?shù)倪@個概念的，所以光譜流式不需要補償這種說法也算是正確的。但是，這并不意味著光譜流式會更加的簡單，因為光譜流式是需要通過光譜解析（Spectral Unmixing）來進行數(shù)據(jù)拆解的，而光譜解析也需要單染對照。UltraComp eBeads Spectral Unmixing Beads (貨號: U20250) 經(jīng)過優(yōu)化于光譜流式細胞術(shù)，通過供精確的單光譜解析對照，增強光譜流式細胞術(shù)的檢測性能。

流式細胞術(shù)是重要的細胞分析方法學，賽默飛世爾科技的Gibco、Invitrogen和Thermo Scientific產(chǎn)品品牌可提供從流式儀器、抗體試劑到豐富資源的流式整體解決方案。其中Invitrogen eBioscience陪伴著每一代流式科學家和技術(shù)人員獲得成果、共同成長，這些年來我們一起見證以Anti-FoxP3為代表的流式抗體深受喜愛、更多種類的流式熒光染料欣然上市以及賽默飛科學家們的十年如一日技術(shù)陪伴，現(xiàn)在有著更豐富的產(chǎn)品和工具，滿足高校研究院、生物技術(shù)公司、藥企等從早期基礎研究到臨床轉(zhuǎn)化和生產(chǎn)等不同階段的需求，加速生命科學行業(yè)的進程發(fā)展。